ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड मानव टी कोशिकाओं का उपयोग करके द्वि-विशिष्ट एंटीबॉडी-प्रेरित टी सेल तस्करी पर नज़र रखना
Summary
यहां, हम ल्यूसिफेरस के साथ मानव टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं ताकि एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता और टी सेल-एंगेजिंग बायोस्पेसिफिक एंटीबॉडी के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए अध्ययन में ट्यूमर के लिए बायोस्पेसिफिक एंटीबॉडी-प्रेरित टी सेल तस्करी के विवो ट्रैकिंग में सुविधा हो सके।
Abstract
टी सेल-एंगेजिंग बाइस्पेसिफिक एंटीबॉडी (टी-बीएसएबी) ठोस ट्यूमर के लिए प्रीक्लिनिकल विकास और नैदानिक परीक्षण के विभिन्न चरणों में हैं। वैधता, स्थानिक व्यवस्था, इंटरडोमेन दूरी और एफसी उत्परिवर्तन जैसे कारक इन उपचारों की एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता को प्रभावित करते हैं, आमतौर पर ट्यूमर के लिए टी कोशिकाओं के होमिंग को प्रभावित करके, जो एक बड़ी चुनौती बनी हुई है। यहां, हम ल्यूसिफेरस के साथ सक्रिय मानव टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने की एक विधि का वर्णन करते हैं, जिससे टी-बीएसएबी थेरेपी अध्ययनों के दौरान टी कोशिकाओं की विवो ट्रैकिंग की अनुमति मिलती है। टी कोशिकाओं को ट्यूमर में पुनर्निर्देशित करने के लिए टी-बीएसएबीएस की क्षमता का उपचार के दौरान कई समय बिंदुओं पर मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को ट्यूमर में टी कोशिकाओं की दृढ़ता के साथ टी-बीएसएबीएस और अन्य हस्तक्षेपों की एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता को सहसंबंधित करने की अनुमति मिलती है। यह विधि टी सेल घुसपैठ का हिस्टोलॉजिकल रूप से आकलन करने के लिए उपचार के दौरान जानवरों की बलि देने की आवश्यकता को कम करती है और उपचार के दौरान और बाद में टी सेल तस्करी के कैनेटीक्स को निर्धारित करने के लिए कई समय बिंदुओं पर दोहराया जा सकता है।
Introduction
टी सेल-एंगेजिंग बाइस्पेसिफिक एंटीबॉडी (टी-बीएसएबी) इंजीनियर एंटीबॉडी हैं जिनका उपयोग पॉलीक्लोनल टी कोशिकाओं को कृत्रिम विशिष्टता प्रदान करने के लिए किया जाता है, जिसमें टी कोशिकाओं को एक बाध्यकारी हाथ के माध्यम से और एक ट्यूमर एंटीजन को दूसरे बाध्यकारी हाथ के माध्यम से संलग्न किया जाता है। इस तकनीक को सफलतापूर्वक हेमेटोलॉजिकल कैंसर (सीडी 19-टारगेटिंग ब्लिनाटुमोमैब1) पर लागू किया गया है, और कई टी-बीएसएबी विभिन्न प्रकार के ठोस ट्यूमर के लिए प्रीक्लिनिकल और नैदानिक विकासमें हैं। टी-बीएसएबी पॉलीक्लोनल टी कोशिकाओं को एक प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) -स्वतंत्र तरीके से संलग्न करते हैं, और इसलिए यहां तक कि ट्यूमर जो मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) को डाउनरेगुलेट करते हैं, इस प्रकारकी चिकित्सा के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। टी-बीएसएबीएस को दर्जनों अलग-अलग प्रारूपों में विकसित किया गया है, जिसमें टी सेल और ट्यूमर बाइंडिंग आर्म्स की वैधता और स्थानिक व्यवस्था, इंटरडोमेन दूरी और एफसी डोमेन को शामिल करने में अंतर है, जो आधे जीवन को प्रभावित करता हैऔर वर्तमान में प्रभावी कार्यों को प्रेरित कर सकता है। हमारी प्रयोगशाला में पिछले काम से पता चला है कि ये कारक टी-बीएसएबीएस की एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता को काफी प्रभावित करते हैं, शक्ति6 में 1,000 गुना अंतर के साथ। इस काम के माध्यम से, हमने टी-बीएसएबी के लिए आदर्श मंच के रूप में आईजीजी-[एल]-एससीएफवी प्रारूप की पहचान की (टी-बीएसएबी प्रारूपों के बारे में अधिक जानकारी के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें), और इस मंच को जीडी 2 (न्यूरोब्लास्टोमा), एचईआर 2 (स्तन कैंसर और ओस्टियोसारकोमा), जीपीए 33 (कोलोरेक्टल कैंसर), एसटीईएपी 1 (इविंग सारकोमा), सीडी 19 (बी सेल मैलिग्नेंसी), और सीडी 33 (बी सेल मैलिग्नेंसी) सहित लक्ष्यों पर लागू किया है। 8,9,10,11,12,13.
ठोस ट्यूमर में टी-बीएसएबी थेरेपी को सफलतापूर्वक लागू करने के लिए प्रमुख चुनौतियों में से एक ट्यूमर14 में टी सेल तस्करी को चलाने के लिए इम्यूनोसप्रेसिव ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) पर काबू पाना है। ऊपर वर्णित टी-बीएसएबी प्रभावकारिता को प्रभावित करने वाले कारकों का ट्यूमर के लिए टी सेल होमिंग को प्रभावी ढंग से प्रेरित करने के लिए टी-बीएसएबीएस की क्षमता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, लेकिन वास्तविक समय में विवो सिस्टम में इस प्रभाव का मूल्यांकन करना मुश्किल है। यह पांडुलिपि उपचार के दौरान प्रयोगात्मक इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड माउस मॉडल में विभिन्न ऊतकों में टी सेल तस्करी का मूल्यांकन करने के लिए टी-बीएसएबीएस के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं के उपयोग का विस्तृत विवरण प्रदान करती है। इस पद्धति का समग्र लक्ष्य ट्यूमर और अन्य ऊतकों में टी सेल घुसपैठ का मूल्यांकन करने के लिए एक साधन प्रदान करना है, साथ ही उपचार के दौरान जानवरों की बलि देने की आवश्यकता के बिना टी सेल होमिंग कैनेटीक्स और दृढ़ता में वास्तविक समय की अंतर्दृष्टि प्रदान करना है। सेलुलर इम्यूनोथेरेपी पर ध्यान केंद्रित करने वाले शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या के लिए, प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल में विवो में टी कोशिकाओं को ट्रैक करने की क्षमता महत्वपूर्ण है। हमारा उद्देश्य उस विधि का संपूर्ण, विस्तृत विवरण प्रदान करना है जिसे हमने ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए नियोजित किया है ताकि अन्य शोधकर्ता इस तकनीक को आसानी से दोहरा सकें।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि टी-बीएसएबी ब्लिनाटुमोमैब को सीडी 19-पॉजिटिव हेमेटोलॉजिकल विकृतियों के लिए अनुमोदित किया गया है, ठोस ट्यूमर में टी-बीएसएबीएस का सफल कार्यान्वयन बहुत अधिक कठिन साबित हुआ है। कैटुमैक्सोमैब, उपकला क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
व्लादिमीर पोनोमारेव इस लेख के प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले ल्यूसिफेरस संरचनाओं को साझा करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030-10G | |
| CD3/CD28 beads | Gibco (ThermoFisher) | 11161D | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | |
| DNA in vitro transfection reagent (polyjet) | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| FBS | Gibco (ThermoFisher) | 10437028 | |
| Gag/pol plasmid | Addgene | 14887 | |
| GFP plasmid | Addgene | 11150-DNA.cg | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco (ThermoFisher) | 15140122 | |
| Recombinant human IL-2 | R&D Systems | 202-IL-010/CF | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Trypsin | Gibco (ThermoFisher) | 25-300-120 | |
| VSV-G plasmid | Addgene | 8454 |
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