Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports mit Luciferase-transduzierten menschlichen T-Zellen
Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Transduktion von humanen T-Zellen mit Luciferase, um die in vivo Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports zu Tumoren in Studien zur Evaluierung der Anti-Tumor-Wirksamkeit und des Mechanismus von T-Zell-bindenden bispezifischen Antikörpern zu ermöglichen.
Abstract
T-Zell-bindende bispezifische Antikörper (T-BsAbs) befinden sich in verschiedenen Stadien der präklinischen Entwicklung und klinischen Erprobung solider Tumore. Faktoren wie Valenz, räumliche Anordnung, Interdomänendistanz und Fc-Mutationen beeinflussen die Anti-Tumor-Wirksamkeit dieser Therapien, in der Regel durch die Beeinflussung des Homings von T-Zellen zu Tumoren, was nach wie vor eine große Herausforderung darstellt. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Transduktion aktivierter humaner T-Zellen mit Luciferase, die es ermöglicht, in vivo T-Zellen während T-BsAb-Therapiestudien zu verfolgen. Die Fähigkeit von T-BsAbs, T-Zellen zu Tumoren umzuleiten, kann zu mehreren Zeitpunkten während der Behandlung quantitativ bewertet werden, was es den Forschern ermöglicht, die Anti-Tumor-Wirksamkeit von T-BsAbs und anderen Interventionen mit der Persistenz von T-Zellen in Tumoren zu korrelieren. Diese Methode verringert die Notwendigkeit, Tiere während der Behandlung zu opfern, um die T-Zell-Infiltration histologisch zu beurteilen, und kann zu mehreren Zeitpunkten wiederholt werden, um die Kinetik des T-Zell-Transports während und nach der Behandlung zu bestimmen.
Introduction
T-Zell-aktivierende bispezifische Antikörper (T-BsAbs) sind technisch hergestellte Antikörper, die verwendet werden, um polyklonalen T-Zellen eine künstliche Spezifität zu verleihen, indem T-Zellen durch einen Bindungsarm und ein Tumorantigen durch einen anderen Bindungsarm angegriffen werden. Diese Technologie wurde erfolgreich bei hämatologischen Krebserkrankungen eingesetzt (CD19-gerichtetes Blinatumomab1), und zahlreiche T-BsAbs befinden sich auch für eine Vielzahl solider Tumore in der präklinischen und klinischen Entwicklung2. T-BsAbs binden polyklonale T-Zellen auf eine vom Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) unabhängige Weise, und daher sind auch Tumore, die humane Leukozytenantigene (HLAs) herunterregulieren, für diese Artder Therapie anfällig 3,4. T-BsAbs wurden in Dutzenden von verschiedenen Formaten entwickelt, mit Unterschieden in der Wertigkeit und räumlichen Anordnung der T-Zell- und Tumorbindungsarme, den Interdomänenabständen und dem Einschluss einer Fc-Domäne, die die Halbwertszeit beeinflusst und Effektorfunktionen induzieren kann, falls vorhanden5. Frühere Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass diese Faktoren die Anti-Tumor-Wirksamkeit von T-BsAbs signifikant beeinflussen, mit bis zu 1.000-fachen Unterschieden in der Potenz6. Durch diese Arbeit haben wir das IgG-[L]-scFv-Format als ideale Plattform für T-BsAbs identifiziert (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse für weitere Details zu T-BsAb-Formaten) und haben diese Plattform auf Ziele wie GD2 (Neuroblastom), HER2 (Brustkrebs und Osteosarkom), GPA33 (Darmkrebs), STEAP1 (Ewing-Sarkom), CD19 (B-Zell-Malignome) und CD33 (B-Zell-Malignome) angewendet7. 8,9,10,11,12,13.
Eine der größten Herausforderungen bei der erfolgreichen Implementierung der T-BsAb-Therapie bei soliden Tumoren ist die Überwindung einer immunsuppressiven Tumormikroumgebung (TME), die den Transport von T-Zellen zu Tumoren fördert14. Die oben beschriebenen Faktoren, die die Wirksamkeit von T-BsAb beeinflussen, haben einen signifikanten Einfluss auf die Fähigkeit von T-BsAbs, T-Zell-Homing zu Tumoren effektiv zu induzieren, aber dieser Effekt ist in einem In-vivo-System in Echtzeit schwer zu bewerten. Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Beschreibung der Verwendung von Luciferase-transduzierten T-Zellen in präklinischen Studien mit T-BsAbs zur Bewertung des T-Zell-Transports in verschiedene Gewebe in experimentellen immungeschwächten Mausmodellen während der Behandlung. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Mittel zur Bewertung der T-Zell-Infiltration in Tumoren und anderen Geweben sowie einen Echtzeit-Einblick in die Kinetik und Persistenz von T-Zellen zu erhalten, ohne dass Tiere während der Behandlung geopfert werden müssen. Für die zunehmende Zahl von Forschern, die sich auf zelluläre Immuntherapien konzentrieren, ist die Fähigkeit, T-Zellen in vivo in präklinischen Tiermodellen zu verfolgen, von entscheidender Bedeutung. Unser Ziel ist es, eine gründliche, detaillierte Beschreibung der Methode zu liefern, die wir zur Verfolgung von Luciferase-transduzierten T-Zellen verwendet haben, damit andere Forscher diese Technik leicht replizieren können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während das T-BsAb Blinatumomab für CD19-positive hämatologische Malignome zugelassen ist, hat sich die erfolgreiche Implementierung von T-BsAbs bei soliden Tumoren als deutlich schwieriger erwiesen. Catumaxomab, ein T-BsAb, das gegen das Epithelzelladhäsionsmolekül (EPCAM) gerichtet ist, wurde für die Behandlung von malignem Aszites bei Patientinnen mit Eierstockkrebs zugelassen, die Produktion des Medikaments wurde jedoch aus kommerziellen Gründen gestoppt19. Für solide Tumore sind keine…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Vladimir Ponomarev für die Bereitstellung der Luciferase-Konstrukte, die in den Experimenten verwendet wurden, die im Abschnitt “Repräsentative Ergebnisse” dieses Artikels beschrieben sind.
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030-10G | |
| CD3/CD28 beads | Gibco (ThermoFisher) | 11161D | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | |
| DNA in vitro transfection reagent (polyjet) | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| FBS | Gibco (ThermoFisher) | 10437028 | |
| Gag/pol plasmid | Addgene | 14887 | |
| GFP plasmid | Addgene | 11150-DNA.cg | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco (ThermoFisher) | 15140122 | |
| Recombinant human IL-2 | R&D Systems | 202-IL-010/CF | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Trypsin | Gibco (ThermoFisher) | 25-300-120 | |
| VSV-G plasmid | Addgene | 8454 |
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