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Abstract
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Immunologia e infezioni

Eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatztechnik für das Screening von Integrin-hemmenden Medikamenten

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatz-Screening-Methode zur Identifizierung niedermolekularer Medikamente, die die β2-Integrin-Aktivierung auf menschlichen Neutrophilen hemmen.

Abstract

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Identifizierung kleiner molekularer Antagonisten der β2-Integrinaktivierung unter Verwendung von Antikörpern zu etablieren, die über Konformationsänderungen berichtende Antikörper und Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie verwenden. Die Methode kann auch als Leitfaden für andere antikörperbasierte Hochdurchsatz-Screening-Methoden dienen. β2-Integrine sind Leukozyten-spezifische Adhäsionsmoleküle, die für die Immunantwort entscheidend sind. Neutrophile Granulozyten sind auf die Integrinaktivierung angewiesen, um den Blutkreislauf zu verlassen, nicht nur, um Infektionen zu bekämpfen, sondern auch, um an mehreren entzündlichen Erkrankungen beteiligt zu sein. Die Kontrolle der β2-Integrin-Aktivierung stellt einen praktikablen Ansatz zur Behandlung von Neutrophilen-assoziierten Entzündungserkrankungen dar. In diesem Protokoll wird ein monoklonaler Antikörper, mAb24, der spezifisch an das hochaffine Kopfstück von β2-Integrinen bindet, verwendet, um die Aktivierung von β2-Integrinen auf isolierten primären humanen Neutrophilen zu quantifizieren. N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) wird als Stimulus zur Aktivierung neutrophiler β2-Integrine verwendet. In dieser Studie wurde ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometer verwendet, das in der Lage ist, 384-Well-Plattenproben automatisch durchzuführen. Die Auswirkungen von 320 Chemikalien auf die β2-Integrin-Hemmung werden innerhalb von 3 h untersucht. Auf diese Weise können Moleküle identifiziert werden, die direkt auf β2-Integrine abzielen oder auf Moleküle im G-Protein-gekoppelten Rezeptor-initiierten Integrin-Inside-Out-Aktivierungssignalweg abzielen.

Introduction

Viele entzündliche Erkrankungen sind durch die Infiltration von Neutrophilen an der Schwellungs- oder Verletzungsstelle gekennzeichnet1. Um in diese Gewebe einzudringen, müssen die Neutrophilen die Rekrutierungskaskade der Neutrophilen durchlaufen, die einen Arrest im Endothel, eine Extravasation über die Gefäßwand und eine Rekrutierung in das Gewebe beinhaltet2. Zirkulierende Neutrophile benötigen eine β2-Integrin-Aktivierung, um diese Kaskade zu vervollständigen, insbesondere für die Arrestphase. Daher können Integrin-hemmende Medikamente, die die Adhäsion, Extravasation und Rekrutierung von Neutrophilen reduzieren, entzündliche Erkrankungen wirksam behandeln 3,4.

β2-Integrine wurden schon früher für entzündliche Erkrankungen ins Visier genommen. Efalizumab, ein monoklonaler Antikörper, der direkt gegen Integrin αLβ2 gerichtet ist, wurde zur Behandlung von Psoriasis5 entwickelt. Efalizumab wurde jedoch aufgrund seiner tödlichen Nebenwirkung – progressiver multifokaler Leukenzephalopathie infolge einer Reaktivierung des JC-Virus – zurückgezogen 6,7. Neue entzündungshemmende Integrin-basierte Therapien sollten die Aufrechterhaltung der antiinfektiösen Funktionen von Leukozyten berücksichtigen, um Nebenwirkungen zu minimieren. Die Nebenwirkungen von Efalizumab könnten auf die verlängerte Zirkulation monoklonaler Antikörper im Blutkreislauf zurückzuführen sein, die langfristig die Immunfunktionen hemmen könnten8. Eine aktuelle Studie zeigt, dass Efalizumab die αLβ2-Vernetzung und die unerwünschte Internalisierung von α4-Integrinen vermittelt, was eine alternative Erklärung für die Nebenwirkungen liefert9. Daher könnten kurzlebige, niedermolekulare Antagonisten dieses Problem vermeiden.

Eine Hochdurchsatzmethode zum Screening von niedermolekularen β2-Integrin-Antagonisten unter Verwendung humaner Neutrophiler wird hier vorgestellt. Die β2-Integrinaktivierung erfordert Konformationsänderungen der Integrin-Ektodomäne, um Zugang zu ihrem Liganden zu erhalten und ihre Bindungsaffinität zu diesem zu erhöhen. Im kanonischen Switchblade-Modell dehnt sich die gebogene geschlossene Integrin-Ektodomäne zunächst zu einer extended-closed Konformation aus und öffnet dann ihr Kopfstück zu einer vollständig aktivierten extended-open Konformation10,11,12,13. Es gibt auch einen alternativen Weg, der vom gebogen-geschlossenen zum gebogen-offenen und ausgestreckt-offenen Weg führt, schließlich 14,15,16,17,18,19. Der konformationsspezifische Antikörper mAb24 bindet an ein Epitop in der humanen β2-I-ähnlichen Domäne, wenn das Kopfstück der Ektodomäne geöffnet ist20,21,22,23.

Hier wird mit mAb24-APC bestimmt, ob die β2-Integrine aktiviert sind. Zur Aktivierung von Neutrophilen und Integrinen wird in diesem Protokoll N-Formylmethionyl-Leucylphenylalanin (fMLP), ein aus Bakterien gewonnenes kurzes chemotaktisches Peptid, das neutrophile β2-Integrine24 aktivieren kann, als Stimulus verwendet. Wenn fMLP an das Fpr1 auf Neutrophilen bindet, werden nachgeschaltete Signalkaskaden aktiviert, an denen G-Proteine, Phospholipase Cβ und Phosphoinositid-3-Kinase-γ beteiligt sind. Diese Signalereignisse führen letztendlich zu einer Integrinaktivierung über den Inside-Out-Signalweg18,25. Neben niedermolekularen Antagonisten, die direkt an β2-Integrine binden und Konformationsänderungen der Integrinaktivierungverhindern 26, würden mit dieser Methode auch Verbindungen nachgewiesen, die Komponenten des β2-Integrin-Inside-Out-Aktivierungssignalwegs hemmen können. Automatisierte Durchflusszytometer ermöglichen ein Hochdurchsatz-Screening. Die Identifizierung neuer Antagonisten kann nicht nur unser Verständnis der Integrin-Physiologie vertiefen, sondern auch translationale Einblicke in die Integrin-basierte Anti-Entzündungstherapie liefern.

Protocol

Heparinisierte Vollblutproben wurden von anonymisierten gesunden menschlichen Spendern nach Einholung der Einverständniserklärung gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki gewonnen, wie vom Institutional Review Board der UConn Health genehmigt. Von allen Spendern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Die Ein-/Ausschlusskriterien für diese Studie wurden sorgfältig entwickelt, um die Eignung der Teilnehmer sicherzustellen und potenzielle Risiken zu minimieren. Die teilnahmeberechtigten Teilnehmer …

Representative Results

Die Daten eines repräsentativen 384-Well-Plattenscreenings (Abbildung 4) zeigten, dass die Negativkontrollen einen MFI von mAb24-APC von 3236 ± 110 aufwiesen, während die Positivkontrollen einen MFI von mAb24-APC von 7588 ± 858 aufwiesen. Der Z’-Faktor für diese Platte beträgt ungefähr 0,33, was innerhalb eines akzeptablen Bereichs31 liegt. Z’ erfordert jedoch eine weitere Validierung in sekundären Assays. Um die Daten zu normalisie…

Discussion

Die Initiierung und Beendigung der Stimulation und Färbung von Neutrophilen wird durch die Zugabe von Neutrophilen und dem Fixiermittel PFA bestimmt. Daher ist es wichtig, das gleiche Zeitintervall zwischen dem Pipettieren von Neutrophilen oder PFA in jede Säule zu gewährleisten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Stimulations- und Färbezeit der Neutrophilen aus jeder Vertiefung konstant bleibt. Aufgrund der kurzen Lebensdauer von Neutrophilen muss das gesamte Experiment, von der Blutentnahme bei den Spendern bis …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Evan Jellison und Frau Li Zhu im Durchflusszytometrie-Kern von UConn Health für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie, Dr. Lynn Puddington in der Abteilung für Immunologie an der UConn Health für ihre Unterstützung der Instrumente, Frau Slawa Gajewska und Dr. Paul Appleton im klinischen Forschungskern von UConn Health für ihre Hilfe bei der Gewinnung von Blutproben. Wir danken Dr. Christopher “Kit” Bonin und Dr. Geneva Hargis von der UConn School of Medicine für ihre Hilfe beim wissenschaftlichen Schreiben und Lektorat dieses Manuskripts. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health, des National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), des National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, eines Career Development Award der American Heart Association (18CDA34110426) und eines Startkapitalfonds von UConn Health unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
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Keywords: Flow CytometryHigh-throughput ScreeningIntegrin InhibitorBeta-2 IntegrinNeutrophilAnti-inflammatoryConformational Change AntibodyFMLPGPCR
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Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
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