JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

इंटीग्रिन-निरोधात्मक दवाओं की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित उच्च-थ्रूपुट तकनीक

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव न्यूट्रोफिल पर β2 इंटीग्रिन सक्रियण को बाधित करने वाली छोटे-अणु दवाओं की पहचान करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि का वर्णन करता है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य β2 इंटीग्रिन सक्रियण के छोटे आणविक विरोधियों की पहचान करने के लिए एक विधि स्थापित करना है, जो विरूपण-परिवर्तन-रिपोर्टिंग एंटीबॉडी और उच्च-थ्रूपुट प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करता है। विधि अन्य एंटीबॉडी-आधारित उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियों के लिए एक गाइड के रूप में भी काम कर सकती है। β2 इंटीग्रिन ल्यूकोसाइट-विशिष्ट आसंजन अणु हैं जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण हैं। न्यूट्रोफिल रक्तप्रवाह से बाहर निकलने के लिए इंटीग्रिन सक्रियण पर भरोसा करते हैं, न केवल संक्रमण से लड़ने के लिए बल्कि कई सूजन संबंधी बीमारियों में भी शामिल होने के लिए। β2 इंटीग्रिन सक्रियण को नियंत्रित करना न्यूट्रोफिल से जुड़े भड़काऊ रोगों के इलाज के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, mAb24, जो विशेष रूप से β2 इंटीग्रिन के उच्च-आत्मीयता हेडपीस से बांधता है, का उपयोग पृथक प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल पर β2 इंटीग्रिन सक्रियण की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। एन-फॉर्माइलमेथियोनिल-ल्यूसिल-फेनिलएलनिन (एफएमएलपी) का उपयोग न्यूट्रोफिल β2 इंटीग्रिन को सक्रिय करने के लिए उत्तेजना के रूप में किया जाता है। इस अध्ययन में स्वचालित रूप से 384-अच्छी तरह से प्लेट नमूने चलाने में सक्षम एक उच्च-थ्रूपुट प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग किया गया था। β2 इंटीग्रिन निषेध पर 320 रसायनों के प्रभाव का मूल्यांकन 3 घंटे के भीतर किया जाता है। अणु जो सीधे β2 इंटीग्रिन को लक्षित करते हैं या जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर-इनसाइड-आउट सक्रियण सिग्नलिंग मार्ग में इंटीग्रिन इनसाइड-आउट एक्टिवेशन सिग्नलिंग मार्ग में अणुओं को लक्षित करते हैं, उन्हें इस दृष्टिकोण के माध्यम से पहचाना जा सकता है।

Introduction

कई सूजन संबंधी बीमारियों को सूजन या चोट के स्थल पर न्यूट्रोफिल की घुसपैठ की विशेषता है1. इन ऊतकों में घुसपैठ करने के लिए, न्यूट्रोफिल को न्यूट्रोफिल भर्ती कैस्केड को पूरा करना होगा, जिसमें एंडोथेलियम को गिरफ्तारी, पोत की दीवार पर अपव्यय और ऊतक2 में भर्ती करना शामिल है। परिसंचारी न्यूट्रोफिल को इस कैस्केड को पूरा करने के लिए β2 इंटीग्रिन सक्रियण की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से गिरफ्तारी चरण के लिए। इस प्रकार, न्यूट्रोफिल आसंजन, एक्सट्रावेशन और भर्ती को कम करने वाली दवाओं को प्रभावी ढंग से सूजन संबंधी बीमारियों 3,4 का इलाज कर सकते हैं।

β2 इंटीग्रिन को पहले भी भड़काऊ बीमारियों के लिए लक्षित किया गया है। Efalizumab, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सीधे इंटीग्रिन αLβ2 को लक्षित करता है, जिसे सोरायसिस5 के इलाज के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, इसके घातक दुष्प्रभाव के कारण efalizumab को वापस ले लिया गया था – जेसी वायरसपुनर्सक्रियन 6,7 के परिणामस्वरूप प्रगतिशील मल्टीफोकल ल्यूकोएन्सेफैलोपैथी। नए विरोधी भड़काऊ इंटीग्रिन-आधारित उपचारों को साइड इफेक्ट्स को कम करने के लिए ल्यूकोसाइट्स के संक्रमण-विरोधी कार्यों को बनाए रखने पर विचार करना चाहिए। efalizumab के दुष्प्रभाव रक्तप्रवाह में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लंबे समय तक परिसंचरण के कारण हो सकते हैं, जो लंबी अवधि में प्रतिरक्षा कार्यों को बाधित कर सकता है8. हाल के एक अध्ययन से पता चलता है कि efalizumab αLβ2 क्रॉसलिंकिंग और α4 इंटीग्रिन के अवांछित आंतरिककरण की मध्यस्थता करता है, जो दुष्प्रभावों के लिए एक वैकल्पिक स्पष्टीकरण प्रदान करताहै। इस प्रकार, अल्पकालिक, छोटे-अणु विरोधी इस समस्या से बच सकते हैं।

मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग करके छोटे-अणु β2 इंटीग्रिन विरोधी को स्क्रीन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि यहां प्रस्तुत की गई है। β2 इंटीग्रिन सक्रियण के लिए इंटीग्रिन एक्टोडोमेन के विरूपण परिवर्तनों की आवश्यकता होती है ताकि इसके लिगैंड तक पहुंच प्राप्त हो सके और इसकी बाध्यकारी आत्मीयता बढ़ सके। विहित स्विचब्लेड मॉडल में, बेंट-क्लोज्ड इंटीग्रिन एक्टोडोमेन पहले एक विस्तारित-बंद रचना तक फैला हुआ है और फिर अपने हेडपीस को पूरी तरह से सक्रिय विस्तारित-खुले रचना10,11,12,13 में खोलता है। एक वैकल्पिक मार्ग भी है जो बेंट-क्लोज्ड से शुरू होकर बेंट-ओपन और एक्सटेंडेड-ओपन तक होता है, अंततः 14,15,16,17,18,19। रचना-विशिष्ट एंटीबॉडी mAb24 मानव β2-I-जैसे डोमेन में एक एपिटोप से बांधता है जब एक्टोडोमेन का हेडपीस20,21,22,23 खुला होता है।

यहां, mAb24-APC का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि β2 इंटीग्रिन सक्रिय हैं या नहीं। न्यूट्रोफिल और इंटीग्रिन को सक्रिय करने के लिए, एन-फॉर्माइलमेथियोनील-ल्यूसिल-फेनिलएलनिन (एफएमएलपी), एक बैक्टीरिया-व्युत्पन्न लघु केमोटैक्टिक पेप्टाइड जो न्यूट्रोफिल β2 इंटीग्रिन24 को सक्रिय कर सकता है, इस प्रोटोकॉल में एक उत्तेजना के रूप में उपयोग किया जाता है। जब fMLP न्यूट्रोफिल पर Fpr1 से बांधता है, तो G-प्रोटीन, फॉस्फोलिपेज़ Cβ, और फॉस्फोइनोसाइटाइड 3-किनेज γ वाले डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड सक्रिय होते हैं। इन सिग्नलिंग घटनाओं के परिणामस्वरूप अंततः अंदर-बाहर सिग्नलिंग मार्ग18,25 के माध्यम से इंटीग्रिन सक्रियण होता है। छोटे अणु विरोधी के अलावा जो सीधे β2 इंटीग्रिन से बंधते हैं और इंटीग्रिन सक्रियण26 के संरूपण परिवर्तनों को रोकते हैं, यौगिक जो β2 इंटीग्रिन अंदर-बाहर सक्रियण सिग्नलिंग मार्ग में घटकों को बाधित कर सकते हैं, इस विधि से भी पता लगाया जाएगा। स्वचालित प्रवाह साइटोमीटर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को सक्षम करते हैं। नए प्रतिपक्षी की पहचान करना न केवल इंटीग्रिन फिजियोलॉजी की हमारी समझ को गहरा कर सकता है, बल्कि इंटीग्रिन-आधारित एंटी-इंफ्लेमेशन थेरेपी में ट्रांसलेशनल अंतर्दृष्टि भी प्रदान कर सकता है।

Protocol

हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों का पालन करते हुए, सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद, सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद हेपरिनाइज्ड पूरे रक्त के नमूने डी-आइडेंटिफाइड स्वस्थ मानव दाताओं से प्राप्त किए गए थे…

Representative Results

एक प्रतिनिधि 384 अच्छी तरह से थाली स्क्रीनिंग (चित्रा 4) से डेटा नकारात्मक नियंत्रण 3236 ± 110 के mAb24-APC के एक MFI था, जबकि सकारात्मक नियंत्रण mAb24 के एक एमएफआई था ± 858 से पता चला. इस प्लेट के लिए Z’ कारक लगभग 0.33 है, …

Discussion

न्यूट्रोफिल उत्तेजना और धुंधला की दीक्षा और समाप्ति न्यूट्रोफिल और लगानेवाला पीएफए के अतिरिक्त द्वारा निर्धारित की जाती है। इसलिए, प्रत्येक स्तंभ में न्यूट्रोफिल या पीएफए को पाइप करने के बीच एक ही स…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम फ्लो साइटोमेट्री में उनकी सहायता के लिए UConn Health में फ्लो साइटोमेट्री कोर में डॉ. इवान जेलिसन और सुश्री ली झू को धन्यवाद देते हैं, UConn Health में इम्यूनोलॉजी विभाग में डॉ. लिन पुडिंग्टन को उपकरणों के समर्थन के लिए, सुश्री स्लावा गजेवस्का और डॉ. पॉल एपलटन को रक्त के नमूने प्राप्त करने में उनकी मदद के लिए UConn Health में क्लिनिकल रिसर्च कोर में। हम इस पांडुलिपि के वैज्ञानिक लेखन और संपादन में उनकी मदद के लिए UConn स्कूल ऑफ मेडिसिन के डॉ. क्रिस्टोफर “किट” बोनिन और डॉ. जिनेवा हरगिस को स्वीकार करते हैं। इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल हार्ट, फेफड़े और ब्लड इंस्टीट्यूट (R01HL145454), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (P20GM121176), यूएसए से अनुदान, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (18CDA34110426) से एक कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड और UConn Health से एक स्टार्टअप फंड द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Keywords: Flow CytometryHigh-throughput ScreeningIntegrin InhibitorBeta-2 IntegrinNeutrophilAnti-inflammatoryConformational Change AntibodyFMLPGPCR
check_url/it/64401?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image