JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
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Immunologia e infezioni

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

このプロトコルは人間の好中球のβ2インテグリンの活発化を禁じる低分子薬剤を識別するために流れのcytometryベースの、ハイスループットのスクリーニング方法を記述する。

Abstract

このプロトコルは、β2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストを特定する方法を確立することを目的としており、コンフォメーション変化報告抗体とハイスループットフローサイトメトリーを利用しています。この分析法は、他の抗体ベースのハイスループットスクリーニング法のガイドとしても役立ちます。β2インテグリンは、免疫応答に重要な白血球特異的な接着分子です。好中球は、感染症と戦うだけでなく、複数の炎症性疾患に関与するために、血流から出るためにインテグリンの活性化に依存しています。β2インテグリンの活性化を制御することは、好中球関連炎症性疾患を治療するための実行可能なアプローチです。このプロトコルでは、モノクローナル抗体であるmAb24は、β2インテグリンの高親和性ヘッドピースに特異的に結合し、単離された一次ヒト好中球のβ2インテグリンの活性化を定量化するために利用されます。N-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)は、好中球β2インテグリンを活性化するための刺激として使用されます。この研究では、384ウェルプレートサンプルを自動的に分析できるハイスループットフローサイトメーターを使用しました。β2 インテグリン阻害に対する 320 種類の化学物質の効果を 3 時間以内に評価します。このアプローチにより、β2インテグリンを直接標的とする分子、またはGタンパク質共役受容体開始インテグリンのインサイドアウト活性化シグナル伝達経路の標的分子を同定することができます。

Introduction

多くの炎症性疾患は、腫れまたは損傷の部位における好中球の浸潤を特徴とする1。これらの組織に浸潤するために、好中球は、内皮への停止、血管壁を横切る血管外漏出、および組織への動員を含む好中球動員カスケードを完了する必要があります2。循環好中球は、特に停止期において、このカスケードを完了するためにβ2インテグリン活性化を必要とします。したがって、好中球の接着、血管外漏出、および動員を減少させるインテグリン阻害薬は、炎症性疾患を効果的に治療する可能性があります3,4。

β2インテグリンは、以前から炎症性疾患の標的となっていました。インテグリンαLβ2を直接標的とするモノクローナル抗体であるエファリズマブは、乾癬の治療薬として開発されました5。しかし、エファリズマブは、JCウイルスの再活性化に起因する進行性多巣性白質脳症という致命的な副作用のために中止されました6,7。新しい抗炎症インテグリンベースの治療法では、副作用を最小限に抑えるために白血球の抗感染機能を維持することを考慮する必要があります。エファリズマブの副作用は、血流中のモノクローナル抗体の循環が長引くことが原因である可能性があり、長期的には免疫機能を阻害する可能性があります8。最近の研究では、エファリズマブがαLβ2架橋とα4インテグリンの望ましくない内在化を媒介することが示されており、副作用の代替的な説明を提供しています9。したがって、短命の低分子アンタゴニストはこの問題を回避できる可能性があります。

ここでは、ヒト好中球を用いた低分子β2インテグリン拮抗薬のスクリーニングのためのハイスループット法を紹介します。β2インテグリンの活性化は、インテグリンエクトドメインへのアクセスとリガンドへの結合親和性の増加を得るために、インテグリンエクトドメインの立体配座変化を必要とします。正準スイッチブレードモデルでは、ベントクローズドインテグリンエクトドメインは、最初に拡張-閉鎖コンフォメーションまで伸長し、次にそのヘッドピースを完全に活性化された拡張-開放コンフォメーションに開きます10,11,12,13。また、ベントクローズドからベントオープン、エクステンデッドオープン、最終的には14,15,16,17,18,19までの代替経路もあります。コンフォメーション特異的抗体mAb24は、エクトドメインのヘッドピースが開いているときにヒトβ2-I様ドメインのエピトープに結合します20,21,22,23。

ここでは、mAb24-APCを使用して、β2インテグリンが活性化されているかどうかを判断します。好中球とインテグリンを活性化するために、好中球β2インテグリン24を活性化できる細菌由来の短い走化性ペプチドであるN-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)をこのプロトコルの刺激として使用します。fMLPが好中球上のFpr1に結合すると、Gタンパク質、ホスホリパーゼCβ、およびホスホイノシチド3-キナーゼγを含む下流のシグナル伝達カスケードが活性化されます。これらのシグナル伝達事象は、最終的に、インサイドアウトシグナル伝達経路を介してインテグリン活性化をもたらす18,25。β2インテグリンに直接結合し、インテグリン活性化の立体構造変化を防ぐ低分子アンタゴニスト26に加えて、β2インテグリンのインサイドアウト活性化シグナル伝達経路の成分を阻害できる化合物もこの方法で検出されます。自動フローサイトメーターにより、ハイスループットスクリーニングが可能になります。新しいアンタゴニストを同定することで、インテグリン生理学の理解が深まるだけでなく、インテグリンベースの抗炎症療法に関するトランスレーショナルな洞察が得られる可能性があります。

Protocol

ヘパリン処理された全血サンプルは、ヘルシンキ宣言の原則に従って、UConn Health の治験審査委員会によって承認されたインフォームド コンセントを取得した後、匿名化された健康な人間のドナーから採取されました。すべてのドナーからインフォームドコンセントが得られました。この研究の選択/除外基準は、参加者の適合性を確保し、潜在的なリスクを最小限に抑えるために慎重に開発?…

Representative Results

代表的な384ウェルプレートスクリーニングのデータ(図4)では、陰性対照のmAb24-APCのMFIは3236±110であり、陽性対照のmAb24-APCのMFIは7588±858であることが明らかになりました。このプレートのZ’係数は約0.33で、許容範囲内です31。ただし、Z’は二次アッセイでさらに検証する必要があります。 データを正規化するために、すべての値をス?…

Discussion

好中球の刺激と染色の開始と終了は、好中球と固定剤PFAの添加によって決定されます。したがって、好中球または PFA を各カラムにピペッティングする間隔を同じにすることが重要です。これにより、各ウェルからの好中球の刺激と染色時間が一定に保たれます。好中球の寿命は短いため、ドナーからの採血からフローサイトメトリーの完了まで、すべての実験を同じ日に実施する必要があ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

UConn HealthのフローサイトメトリーコアのEvan Jellison博士とLi Zhu氏にはフローサイトメトリーの支援を、UConn Healthの免疫学部門のLynn Puddington博士には機器のサポートを、UConn Healthの臨床研究コアには血液サンプルの採取に協力していただいたSlawa Gajewska氏とPaul Appleton博士に感謝します。UConn School of MedicineのChristopher “Kit” Bonin博士とGeneva Hargis博士には、この原稿の科学的執筆と編集に協力していただいたことに感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所、国立心肺血液研究所(R01HL145454)、米国国立総合医学研究所(P20GM121176)、米国心臓協会からのキャリア開発賞(18CDA34110426)、およびUConn Healthからのスタートアップ資金の支援を受けました。 図 1 は BioRender.com で作成されました。

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
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Keywords: Flow CytometryHigh-throughput ScreeningIntegrin InhibitorBeta-2 IntegrinNeutrophilAnti-inflammatoryConformational Change AntibodyFMLPGPCR
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Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
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