JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Immunologia e infezioni

En flowcytometribasert høykapasitetsteknikk for screening av integrinhemmende legemidler

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Denne protokollen beskriver en flowcytometribasert, høy gjennomstrømningsscreeningsmetode for å identifisere småmolekylære legemidler som hemmer β2-integrinaktivering på humane nøytrofiler.

Abstract

Denne protokollen tar sikte på å etablere en metode for å identifisere små molekylære antagonister av β2-integrinaktivering, ved bruk av konformasjonsendringsrapporterende antistoffer og høy gjennomstrømningscytometri. Metoden kan også tjene som en veiledning for andre antistoffbaserte screeningsmetoder med høy gjennomstrømning. β2-integriner er leukocyttspesifikke adhesjonsmolekyler som er avgjørende for immunresponser. Neutrofiler stole på integrinaktivering for å gå ut av blodet, ikke bare for å bekjempe infeksjoner, men også for å være involvert i flere inflammatoriske sykdommer. Kontroll av β2-integrinaktivering gir en levedyktig tilnærming for behandling av nøytrofilassosierte inflammatoriske sykdommer. I denne protokollen brukes et monoklonalt antistoff, mAb24, som spesifikt binder seg til hodestykket med høy affinitet av β2-integriner, for å kvantifisere β2-integrinaktivering på isolerte primære humane nøytrofiler. N-formylmetionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP) brukes som et stimulus for å aktivere nøytrofile β2-integriner. Et cytometer med høy gjennomstrømningsstrøm som er i stand til automatisk å kjøre 384-brønns plateprøver ble brukt i denne studien. Effektene av 320 kjemikalier på β2 integrinhemming vurderes innen 3 timer. Molekyler som direkte retter seg mot β2-integriner eller målmolekyler i G-proteinkoblet reseptorinitiert integrin innvendig ut aktiveringssignalvei, kan identifiseres gjennom denne tilnærmingen.

Introduction

Mange inflammatoriske sykdommer er preget av infiltrering av nøytrofiler på stedet for hevelse eller skade1. For å infiltrere disse vevene, må nøytrofiler fullføre nøytrofil rekrutteringskaskade, som innebærer arrestasjon til endotelet, ekstravasasjon over karveggen og rekruttering til vevet2. Sirkulerende nøytrofiler trenger β2 integrinaktivering for å fullføre denne kaskaden, spesielt for arrestasjonsfasen. Dermed kan integrinhemmende legemidler som reduserer nøytrofil adhesjon, ekstravasasjon og rekruttering effektivt behandle inflammatoriske sykdommer 3,4.

β2 integriner har vært målrettet for inflammatoriske sykdommer før. Efalizumab, et monoklonalt antistoff direkte rettet mot integrin αLβ2, ble utviklet for å behandle psoriasis5. Efalizumab ble imidlertid seponert på grunn av den dødelige bivirkningen – progredierende multifokal leukoencefalopati som følge av reaktivering av JC-virus 6,7. Nye antiinflammatoriske integrinbaserte terapier bør vurdere å opprettholde antiinfeksjonsfunksjonene til leukocytter for å minimere bivirkninger. Bivirkningene av efalizumab kan skyldes langvarig sirkulasjon av monoklonale antistoffer i blodet, noe som kan hemme immunfunksjoner pålang sikt. En nylig studie viser at efalizumab medierer αLβ2-kryssbinding og uønsket internalisering av α4-integriner, noe som gir en alternativ forklaring på bivirkningene9. Dermed kan kortvarige, småmolekylære antagonister unngå dette problemet.

En høy gjennomstrømningsmetode for å skjerme småmolekylære β2-integrinantagonister ved bruk av humane nøytrofiler presenteres her. β2 integrinaktivering krever konformasjonsendringer av integrinektodomenet for å få tilgang til og øke bindingsaffiniteten til liganden. I den kanoniske springbladmodellen strekker det bøyde-lukkede integrinektodomenet seg først til en utvidet-lukket konformasjon og åpner deretter hodestykket for en fullt aktivert utvidet-åpen konformasjon10,11,12,13. Det finnes også en alternativ trasé som starter fra bøyd-lukket til bøyd-åpen og forlenget-åpen, til slutt 14,15,16,17,18,19. Det konformasjonsspesifikke antistoffet mAb24 binder seg til en epitop i det humane β2-I-lignende domenet når hodestykket til ektodomenet er åpent20,21,22,23.

Her brukes mAb24-APC for å bestemme om β2-integrinene er aktivert. For å aktivere nøytrofiler og integrin, brukes N-formylmetionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP), et bakterielt avledet kort kjemotaktisk peptid som kan aktivere nøytrofile β2-integriner24, som et stimulus i denne protokollen. Når fMLP binder seg til Fpr1 på nøytrofiler, aktiveres nedstrøms signalkaskader som involverer G-proteiner, fosfolipase Cβ og fosfoinositid 3-kinase γ. Disse signalhendelsene resulterer til slutt i integrinaktivering via signalveieninnsiden ut 18,25. Foruten små molekylantagonister som direkte binder seg til β2-integriner og forhindrer konformasjonsendringer av integrinaktivering26, vil forbindelser som kan hemme komponenter i β2-integrinet innvendig ut aktiveringssignalvei også bli detektert med denne metoden. Automatiserte flowcytometre muliggjør screening med høy gjennomstrømning. Identifisering av nye antagonister kan ikke bare utdype vår forståelse av integrinfysiologi, men også gi translasjonell innsikt i integrinbasert antiinflammasjonsterapi.

Protocol

Hepariniserte fullblodsprøver ble oppnådd fra avidentifiserte friske menneskelige givere etter å ha innhentet informert samtykke, som godkjent av Institutional Review Board of UConn Health, etter prinsippene i Helsinkideklarasjonen. Informert samtykke ble innhentet fra alle donorer. Inklusjons-/eksklusjonskriteriene for denne studien ble nøye utviklet for å sikre deltakernes egnethet og for å minimere potensiell risiko. Kvalifiserte deltakere var i alderen mellom 18 og 65 år, uansett etnisitet, flytende i engelsk …

Representative Results

Data fra en representativ 384-brønns platescreening (figur 4) viste at negative kontroller hadde en MFI på mAb24-APC på 3236 ± 110, mens positive kontroller hadde en MFI på mAb24-APC på 7588 ± 858. Z-faktoren for denne platen er ca. 0,33, som er innenfor et akseptabelt område31. Z’ krever imidlertid ytterligere validering i sekundære analyser. For å normalisere dataene ble alle verdier skalert for å tilordne en maksimumsverdi på…

Discussion

Initiering og avslutning av nøytrofil stimulering og farging bestemmes ved tilsetning av nøytrofiler og fikseringsmiddel PFA. Derfor er det viktig å sikre samme tidsintervall mellom pipettering av nøytrofiler eller PFA i hver kolonne. Dette sikrer at stimulerings- og fargetiden til nøytrofiler fra hver brønn forblir konsistent. På grunn av den korte levetiden til nøytrofiler, må hele forsøket, fra å samle blod fra givere til å fullføre flowcytometri, utføres samme dag. Nøytrofile granulocytter er svært f?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Evan Jellison og Li Zhu i flowcytometrikjernen ved UConn Health for deres hjelp med flowcytometri, Dr. Lynn Puddington ved Institutt for immunologi ved UConn Health for hennes støtte til instrumentene, Slawa Gajewska og Dr. Paul Appleton i den kliniske forskningskjernen ved UConn Health for deres hjelp med å skaffe blodprøver. Vi anerkjenner Dr. Christopher “Kit” Bonin og Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for deres hjelp med vitenskapelig skriving og redigering av dette manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, en karriereutviklingspris fra American Heart Association (18CDA34110426), og et oppstartsfond fra UConn Health. Figur 1 ble laget med BioRender.com.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Keywords: Flow CytometryHigh-throughput ScreeningIntegrin InhibitorBeta-2 IntegrinNeutrophilAnti-inflammatoryConformational Change AntibodyFMLPGPCR
check_url/it/64401?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image