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Immunologia e infezioni

Una técnica de alto rendimiento basada en citometría de flujo para el cribado de fármacos inhibidores de integrinas

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Este protocolo describe un método de cribado de alto rendimiento basado en citometría de flujo para identificar fármacos de moléculas pequeñas que inhiben la activación de la integrina β2 en neutrófilos humanos.

Abstract

Este protocolo tiene como objetivo establecer un método para identificar pequeños antagonistas moleculares de la activación de integrinas β2, utilizando anticuerpos que informan de cambios conformacionales y citometría de flujo de alto rendimiento. El método también puede servir como guía para otros métodos de cribado de alto rendimiento basados en anticuerpos. Las integrinas β2 son moléculas de adhesión específicas de los leucocitos que son cruciales en las respuestas inmunitarias. Los neutrófilos dependen de la activación de la integrina para salir del torrente sanguíneo, no solo para combatir infecciones, sino también para estar involucrados en múltiples enfermedades inflamatorias. El control de la activación de la integrina β2 presenta un enfoque viable para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias asociadas a los neutrófilos. En este protocolo, se utiliza un anticuerpo monoclonal, mAb24, que se une específicamente a la pieza principal de alta afinidad de las integrinas β2, para cuantificar la activación de las integrinas β2 en neutrófilos humanos primarios aislados. La N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) se utiliza como estímulo para activar las integrinas β2 de los neutrófilos. En este estudio se utilizó un citómetro de flujo de alto rendimiento capaz de procesar automáticamente muestras de placas de 384 pocillos. Los efectos de 320 sustancias químicas sobre la inhibición de la integrina β2 se evalúan en 3 h. A través de este enfoque, se pueden identificar moléculas que se dirigen directamente a las integrinas β2 o moléculas diana en la vía de señalización de activación de la integración iniciada por el receptor acoplado a la proteína G de adentro hacia afuera.

Introduction

Muchas enfermedades inflamatorias se caracterizan por la infiltración de neutrófilos en el sitio de la hinchazón o lesión1. Para infiltrarse en estos tejidos, los neutrófilos deben completar la cascada de reclutamiento de neutrófilos, que implica la detención del endotelio, la extravasación a través de la pared del vaso y el reclutamiento en el tejido2. Los neutrófilos circulantes necesitan la activación de la integrina β2 para completar esta cascada, especialmente para la fase de detención. Por lo tanto, los fármacos inhibidores de integrinas que reducen la adhesión, la extravasación y el reclutamiento de neutrófilos pueden tratar eficazmente las enfermedades inflamatorias 3,4.

Las integrinas β2 han sido atacadas para enfermedades inflamatorias anteriormente. El efalizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido directamente a la integrina αLβ2, se desarrolló para tratar la psoriasis5. Sin embargo, el efalizumab fue retirado debido a su efecto secundario letal: leucoencefalopatía multifocal progresiva resultante de la reactivación del virus JC 6,7. Las nuevas terapias antiinflamatorias basadas en integrinas deben considerar el mantenimiento de las funciones antiinfecciosas de los leucocitos para minimizar los efectos secundarios. Los efectos secundarios del efalizumab podrían deberse a la circulación prolongada de anticuerpos monoclonales en el torrente sanguíneo, lo que podría inhibir las funciones inmunitarias a largo plazo8. Un estudio reciente muestra que efalizumab media la reticulación αLβ2 y la internalización no deseada de las integrinas α4, proporcionando una explicación alternativa para los efectos secundarios9. Por lo tanto, los antagonistas de moléculas pequeñas de corta duración podrían evitar este problema.

Aquí se presenta un método de alto rendimiento para cribar antagonistas de integrinas β2 de moléculas pequeñas utilizando neutrófilos humanos. La activación de la integrina β2 requiere cambios conformacionales del ectodominio de la integrina para acceder y aumentar su afinidad de unión a su ligando. En el modelo canónico de navaja, el ectodominio de integrina doblada-cerrada primero se extiende a una conformación extendida-cerrada y luego abre su casco a una conformación extendida-abierta completamente activada10,11,12,13. También existe una vía alternativa que parte de la curva-cerrada a la curva-abierta y extendida-abierta, eventualmente 14,15,16,17,18,19. El anticuerpo conformacional específico mAb24 se une a un epítopo en el dominio humano similar a β2-I cuando la cabeza del ectodominio está abierta20,21,22,23.

En este caso, se utiliza mAb24-APC para determinar si las integrinas β2 están activadas. Para activar los neutrófilos y la integrina, se utiliza como estímulo en este protocolo la N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), un péptido quimiotáctico corto derivado de bacterias que puede activar las integrinas β2 de los neutrófilos24. Cuando fMLP se une a Fpr1 en los neutrófilos, se activan cascadas de señalización aguas abajo que involucran proteínas G, fosfolipasa Cβ y fosfoinositida 3-quinasa γ. Estos eventos de señalización finalmente resultan en la activación de la integrina a través de la vía de señalización de adentro hacia afuera18,25. Además de los antagonistas de moléculas pequeñas que se unen directamente a las integrinas β2 y evitan los cambios conformacionales de la activación de las integrinas26, con este método también se detectarían compuestos que pueden inhibir los componentes de la vía de señalización de activación de la integrina β2 de adentro hacia afuera. Los citómetros de flujo automatizados permiten un cribado de alto rendimiento. La identificación de nuevos antagonistas no solo puede profundizar nuestra comprensión de la fisiología de las integrinas, sino que también puede proporcionar información traslacional sobre la terapia antiinflamatoria basada en integrinas.

Protocol

Se obtuvieron muestras de sangre entera heparinizadas de donantes humanos sanos no identificados después de obtener el consentimiento informado, según lo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de UConn Health, siguiendo los principios de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes. Los criterios de inclusión/exclusión para este estudio se desarrollaron cuidadosamente para garantizar la idoneidad de los participantes y minimizar los riesgos potenciales. Los partic…

Representative Results

Los datos de un cribado representativo de placas de 384 pocillos (Figura 4) revelaron que los controles negativos tenían un IMF de mAb24-APC de 3236 ± 110, mientras que los controles positivos tenían un MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. El factor Z’ para esta placa es de aproximadamente 0,33, que está dentro de un rango aceptablede 31. Sin embargo, Z’ requiere una validación adicional en ensayos secundarios. Para normalizar los datos, t…

Discussion

El inicio y la terminación de la estimulación y tinción de neutrófilos están determinados por la adición de neutrófilos y el fijador PFA. Por lo tanto, es fundamental garantizar el mismo intervalo de tiempo entre el pipeteo de neutrófilos o PFA en cada columna. Esto asegura que el tiempo de estimulación y tinción de los neutrófilos de cada pocillo permanezca constante. Debido a la corta vida útil de los neutrófilos, todo el experimento, desde la recolección de sangre de los donantes hasta la realización de…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Evan Jellison y a la Sra. Li Zhu del núcleo de citometría de flujo de UConn Health por su ayuda con la citometría de flujo, a la Dra. Lynn Puddington del Departamento de Inmunología de UConn Health por su apoyo a los instrumentos, a la Sra. Slawa Gajewska y al Dr. Paul Appleton del núcleo de investigación clínica de UConn Health por su ayuda en la obtención de muestras de sangre. Agradecemos al Dr. Christopher “Kit” Bonin y a la Dra. Geneva Hargis de la Facultad de Medicina de UConn por su ayuda con la redacción científica y la edición de este manuscrito. Esta investigación contó con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (R01HL145454), el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (P20GM121176), EE. UU., un Premio al Desarrollo Profesional de la Asociación Americana del Corazón (18CDA34110426) y un fondo inicial de UConn Health. La figura 1 se creó con BioRender.com.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
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Riferimenti

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

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Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
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