JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

En flödescytometribaserad high-throughput-teknik för screening av integrinhämmande läkemedel

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Detta protokoll beskriver en flödescytometribaserad screeningmetod med hög genomströmning för att identifiera småmolekylära läkemedel som hämmar β2-integrinaktivering på humana neutrofiler.

Abstract

Detta protokoll syftar till att etablera en metod för att identifiera små molekylära antagonister av β2-integrinaktivering, med hjälp av antikroppar som rapporterar konformationsförändringar och flödescytometri med hög genomströmning. Metoden kan också fungera som en guide för andra antikroppsbaserade screeningmetoder med hög kapacitet. β2-integriner är leukocytspecifika adhesionsmolekyler som är avgörande för immunsvar. Neutrofiler är beroende av integrinaktivering för att lämna blodomloppet, inte bara för att bekämpa infektioner utan också för att vara involverade i flera inflammatoriska sjukdomar. Att kontrollera aktiveringen av β2-integrin är ett gångbart tillvägagångssätt för behandling av neutrofilassocierade inflammatoriska sjukdomar. I detta protokoll används en monoklonal antikropp, mAb24, som specifikt binder till högaffinitetsstycket i β2-integriner, för att kvantifiera β2-integrinaktivering på isolerade primära humana neutrofiler. N-formylmetionylleucylfenylalanin (fMLP) används som en stimulans för att aktivera neutrofila β2-integriner. En flödescytometer med hög genomströmning som automatiskt kan köra 384-brunnars plattprover användes i denna studie. Effekterna av 320 kemikalier på hämning av β2-integrin bedöms inom 3 timmar. Molekyler som direkt riktar sig mot β2-integriner eller målmolekyler i den G-proteinkopplade receptorinitierade integrin-inifrån och ut-aktiveringssignalvägen kan identifieras genom detta tillvägagångssätt.

Introduction

Många inflammatoriska sjukdomar kännetecknas av infiltration av neutrofiler på platsen för svullnad eller skada1. För att infiltrera dessa vävnader måste neutrofiler slutföra neutrofilrekryteringskaskaden, vilket innebär att endotelet arresteras, extravasering över kärlväggen och rekrytering till vävnad2. Cirkulerande neutrofiler behöver β2-integrinaktivering för att fullborda denna kaskad, särskilt för stoppfasen. Integrinhämmande läkemedel som minskar adhesion, extravasering och rekrytering av neutrofila granulocyter kan således effektivt behandla inflammatoriska sjukdomar 3,4.

β2-integriner har tidigare varit måltavla för inflammatoriska sjukdomar. Efalizumab, en monoklonal antikropp som direkt riktar sig mot integrin αLβ2, utvecklades för att behandla psoriasis5. efalizumab sattes dock ut på grund av dess dödliga biverkning – progressiv multifokal leukoencefalopati till följd av reaktivering av JC-virus 6,7. Nya antiinflammatoriska integrinbaserade terapier bör överväga att upprätthålla leukocyternas infektionshämmande funktioner för att minimera biverkningarna. Biverkningarna av efalizumab kan bero på den förlängda cirkulationen av monoklonala antikroppar i blodomloppet, vilket kan hämma immunfunktioner på lång sikt8. En nyligen genomförd studie visar att efalizumab medierar αLβ2-tvärbindning och oönskad internalisering av α4-integriner, vilket ger en alternativ förklaring till biverkningarna9. Således kan kortlivade, småmolekylära antagonister undvika detta problem.

En storskalig metod för att screena småmolekylära β2-integrinantagonister med hjälp av humana neutrofiler presenteras här. β2-integrinaktivering kräver konformationsförändringar av integrinektodomänen för att få tillgång till och öka dess bindningsaffinitet till dess ligand. I den kanoniska switchblade-modellen sträcker sig den böjda integrinektodomänen först till en utsträckt-sluten konformation och öppnar sedan sitt huvudstycke till en fullt aktiverad utsträckt-öppen konformation10,11,12,13. Det finns också en alternativ väg som börjar från den böjda stängda till böjd-öppen och utsträckt-öppen, så småningom 14,15,16,17,18,19. Den konformationsspecifika antikroppen mAb24 binder till en epitop i den humana β2-I-liknande domänen när ektodomänens huvudstycke är öppet20,21,22,23.

Här används mAb24-APC för att avgöra om β2-integrinerna är aktiverade. För att aktivera neutrofiler och integrin används N-formylmetionyl-leucylfenylalanin (fMLP), en bakteriehärledd kort kemotaktisk peptid som kan aktivera neutrofila β2-integriner24, som en stimulans i detta protokoll. När fMLP binder till Fpr1 på neutrofiler aktiveras nedströms signalkaskader som involverar G-proteiner, fosfolipas Cβ och fosfoinositid-3-kinas γ. Dessa signaleringshändelser resulterar i slutändan i integrinaktivering via inifrån och ut-signalvägen18,25. Förutom småmolekylära antagonister som direkt binder till β2-integriner och förhindrar konformationsförändringar av integrinaktivering26, skulle föreningar som kan hämma komponenter i β2-integrin-inifrån och ut-aktiveringssignalvägen också detekteras med denna metod. Automatiserade flödescytometrar möjliggör screening med hög genomströmning. Att identifiera nya antagonister kan inte bara fördjupa vår förståelse av integrinfysiologi utan också ge translationell insikt i integrinbaserad antiinflammatorisk terapi.

Protocol

Hepariniserade helblodsprover erhölls från avidentifierade friska mänskliga donatorer efter att ha erhållit informerat samtycke, som godkänts av Institutional Review Board of UConn Health, i enlighet med principerna i Helsingforsdeklarationen. Informerat samtycke inhämtades från alla donatorer. Inklusions-/exklusionskriterierna för denna studie har noggrant utvecklats för att säkerställa deltagarnas lämplighet och för att minimera potentiella risker. Berättigade deltagare var mellan 18 och 65 år, av alla e…

Representative Results

Data från en representativ 384-brunnars plattscreening (Figur 4) visade att negativa kontroller hade ett MFI på mAb24-APC på 3236 ± 110, medan positiva kontroller hade ett MFI på mAb24-APC på 7588 ± 858. Z’-faktorn för denna platta är cirka 0,33, vilket ligger inom ett acceptabelt intervall31. Z’ kräver dock ytterligare validering i sekundära analyser. För att normalisera data skalades alla värden för att tilldela ett högsta …

Discussion

Initiering och avslutning av stimulering och färgning av neutrofila granulocyter bestäms genom tillsats av neutrofiler och fixeringsmedlet PFA. Därför är det viktigt att säkerställa samma tidsintervall mellan pipettering av neutrofiler eller PFA i varje kolonn. Detta säkerställer att stimulerings- och färgningstiden för neutrofiler från varje brunn förblir konsekvent. På grund av neutrofilernas korta livslängd måste hela experimentet, från insamling av blod från givare till fullständig flödescytometri…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Dr. Evan Jellison och Ms. Li Zhu i flödescytometrikärnan vid UConn Health för deras hjälp med flödescytometri, Dr. Lynn Puddington i avdelningen för immunologi vid UConn Health för hennes stöd till instrumenten, Ms. Slawa Gajewska och Dr. Paul Appleton i den kliniska forskningskärnan vid UConn Health för deras hjälp med att ta blodprover. Vi tackar Dr. Christopher “Kit” Bonin och Dr. Geneva Hargis från UConn School of Medicine för deras hjälp med vetenskapligt skrivande och redigering av detta manuskript. Denna forskning stöddes av anslag från National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, ett Career Development Award från American Heart Association (18CDA34110426) och en startfond från UConn Health. Figur 1 skapades med BioRender.com.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Keywords: Flow CytometryHigh-throughput ScreeningIntegrin InhibitorBeta-2 IntegrinNeutrophilAnti-inflammatoryConformational Change AntibodyFMLPGPCR
check_url/it/64401?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image