Qui presentiamo protocolli per l'identificazione e la purificazione delle cellule ovariche dai follicoli antrali. Elaboriamo i metodi per l'elaborazione di ovaie intere per la crioconservazione di strisce corticali e allo stesso tempo raccogliamo follicoli antrali intatti che vengono trattati enzimaticamente per liberare più tipi di cellule residenti nel follicolo, tra cui granulosa, teca, endoteliale, ematopoietica e cellule stromali.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Estrazione, etichettatura e purificazione di cellule specifiche del lignaggio da follicoli antrali umani
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attivazione, la crescita, lo sviluppo e la maturazione degli ovociti è un processo complesso che è coordinato non solo tra più tipi di cellule dell'ovaio, ma anche attraverso più punti di controllo all'interno del circuito ipotalamo / ipofisi / ovarico. All'interno dell'ovaio, più tipi di cellule specializzate crescono in stretta associazione con l'ovocita all'interno dei follicoli ovarici. La biologia di queste cellule è stata ben descritta nelle fasi successive, quando sono facilmente recuperate come sottoprodotti dei trattamenti di riproduzione assistita. Tuttavia, l'analisi approfondita di piccoli follicoli antrali isolati direttamente dall'ovaio non viene comunemente effettuata a causa della scarsità di tessuto ovarico umano e del limitato accesso all'ovaio nelle pazienti sottoposte a trattamenti di riproduzione assistita.
Questi metodi per il trattamento di ovaie intere per la crioconservazione di strisce corticali con la concomitante identificazione/isolamento delle cellule residenti nell'ovaio consentono l'analisi ad alta risoluzione delle prime fasi dello sviluppo del follicolo antrale. Dimostriamo protocolli per isolare tipi di cellule discrete trattando enzimaticamente i follicoli antrali e separando le cellule granulosa, teca, endoteliale, ematopoietica e stromale. L'isolamento delle cellule dai follicoli antrali a varie dimensioni e fasi di sviluppo consente l'analisi completa dei meccanismi cellulari e molecolari che guidano la crescita del follicolo e la fisiologia ovarica e fornisce una fonte di cellule vitali che possono essere coltivate in vitro per ricapitolare il microambiente follicolare.
Introduzione
Gli elementi funzionali primari dell'ovaio umano sono i follicoli, che governano la crescita e lo sviluppo degli ovociti. I protocolli per l'isolamento delle cellule follicolari sono stati ben stabiliti nel contesto della fecondazione in vitro , ma questi sono appropriati solo per la raccolta di cellule da follicoli luteinizzati nel punto di prelievo ovocitario1. Abbiamo sviluppato un protocollo che consente l'isolamento di popolazioni cellulari discrete da follicoli antrali in diversi stadi di sviluppo che derivano da ovaie native o tessuto ovarico xenotrapiantato2. Sebbene vi sia consenso sul fatto che i contr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso Weill Cornell Medicine. Tutti gli esperimenti di xenotrapianto, utilizzando tessuto ovarico, sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Entrambe le ovaie sono state isolate da un donatore di organi cerebralmente morto di 14 anni senza storia di radio / chemioterapia e nessuna storia documentata di condizioni endocrine o riproduttive. Il comitato di revisione istituzionale (IRB) della Weill Cornell Medicine ha approvato la raccolta di tessuti e l'approvazione da parte della famiglia del donatore di organi è....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Abbiamo isolato i follicoli dalla superficie dell'ovaio e li abbiamo trattati enzimaticamente per isolare i GC e le cellule di teca e stroma che circondano la cavità antrale. Le cellule sono state raccolte e le frazioni cellulari sono state selezionate dai follicoli antrali (diametri compresi tra 0,5 mm e 4 mm) mediante FACS a purezza del >95% (Figura 1).
Per etichettare e purificare frazioni cellulari uniche all'interno dei follicoli antrali umani, abbiamo com.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Una migliore risoluzione della diversità cellulare all'interno dei follicoli ovarici è clinicamente importante per diversi motivi. Nell'applicare il protocollo di cui sopra all'isolamento dei sottotipi fenotipici unici che risiedono all'interno dei follicoli dello stadio antrale, devono essere considerati diversi fattori. In primo luogo, la salute e la vitalità del tessuto ovarico da cui deriva il follicolo antrale è fondamentale per determinare la qualità delle cellule e il successo delle applicazioni a valle. Questo pu.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il sostegno del Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) e dell'Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G è supportato dalla borsa di studio post-dottorato NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sostanze chimiche, reagenti | |||
| Antibiotico-Antimicotico 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Soluzione montante | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase da Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, polvere | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimetil solfossido |
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Terreno di distacco cellulare enzimatico | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Siero fetale bovino, inattivato termicamente | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Soluzione salina bilanciata | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | senza calcio, senza magnesio, senza fenolo |
| rosso Leibovitz' s L-15 medio | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Qualità salina normale | Biologico | 114-055-101 | |
| Saccarosio | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Mezzo di congelamento (100 mL, filtrato attraverso un filtro da 0,2 micron) | |||
| - 69,64 mL di L-15 | |||
| - 17,66 mL di feto bovino siero | |||
| - 3,42 g di saccarosio | |||
| - 10,65 ml di DMSO- | |||
| 1 ml di antibiotico-antimicotico | |||
| Lab Plasticware e forniture | |||
| 6 pozzetti Fondo piatto trasparente non trattato | Corning | 351146 | Falcon |
| 100 & micro; m | Fisher scientific | 352360 | Corning, |
| Falcon Cryovials | Thermo Fisher Scientific 377267 | CryoTube 1,8 mL | |
| Piastra di Petri, P x A 150 mm x 25 mm | Provette in polistirene a fondo tondo Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| con tappo a scatto per filtro cellulare, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, |
| filtro sottovuoto Falcon, sistema di flaconi per vuoto/flaconi di conservazione, 0,22 e micro; m | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R& D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Strumenti chirurgici | |||
| pinza lunga (~150 mm di lunghezza) | Fisherbrand | 12-000-128 | Pinze medie Fisher Scientific |
| (~110 mm di lunghezza) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| numero 21 bisturi | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| numero 11 bisturi | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| forbici curve fini affilate | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Selezionatore cellulare attivato a fluorescenza | BD | ||
| LSM 710 META Microscopio confocale | Zeiss |
Riferimenti
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250(2015).
- Man, L., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
