यहां, हम उच्च, दीर्घकालिक, स्थिर, ऑन-टारगेट साइलेंसिंग दक्षता और कम जीनोम-वाइड, ऑफ-टारगेट गतिविधि के साथ इंजीनियर ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स (ईटीआर) के इन विट्रो चयन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह वर्कफ़्लो उम्मीदवार ईटीआर के प्रारंभिक, जटिल प्रदर्शनों को एक छोटी सूची में कम करने की अनुमति देता है, जो चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक सेटिंग्स में आगे के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।
जीन निष्क्रियता जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है और रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के उपचार के लिए एक आशाजनक रणनीति का प्रतिनिधित्व करती है। पारंपरिक प्रौद्योगिकियों में, आरएनए हस्तक्षेप आंशिक लक्ष्य निरस्तीकरण और जीवन भर के उपचार की आवश्यकता से ग्रस्त है। इसके विपरीत, कृत्रिम न्यूक्लियस डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) के प्रेरण के माध्यम से स्थिर जीन निष्क्रियता लागू कर सकते हैं, लेकिन हाल के अध्ययन इस दृष्टिकोण की सुरक्षा पर सवाल उठा रहे हैं। इंजीनियर ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स (ईटीआर) के माध्यम से लक्षित एपिजेनेटिक संपादन एक समाधान का प्रतिनिधित्व कर सकता है, क्योंकि विशिष्ट ईटीआर संयोजनों के एकल प्रशासन से डीएनए ब्रेक को प्रेरित किए बिना टिकाऊ साइलेंसिंग हो सकती है।
ईटीआर प्रोटीन होते हैं जिनमें एक प्रोग्राम करने योग्य डीएनए-बाइंडिंग डोमेन (डीबीडी) होता है और स्वाभाविक रूप से होने वाले ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स से प्रभावकारक होते हैं। विशेष रूप से, मानव ZNF10 के KRAB डोमेन से लैस तीन ETR का एक संयोजन, मानव DNMT3A और मानव DNMT3L का उत्प्रेरक डोमेन, ETR-लक्ष्य जीन पर आनुवंशिक दमनकारी एपिजेनेटिक राज्यों को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था। इस मंच की हिट-एंड-रन प्रकृति, लक्ष्य के डीएनए अनुक्रम पर प्रभाव की कमी, और मांग पर डीएनए डिमिथाइलेशन द्वारा दमनकारी स्थिति में लौटने की संभावना, एपिजेनेटिक साइलेंसिंग को एक गेम-चेंजिंग टूल बनाती है। एक महत्वपूर्ण कदम लक्ष्य जीन पर उचित ईटीआर की स्थिति की पहचान करना है ताकि लक्ष्य को अधिकतम किया जा सके और ऑफ-टारगेट साइलेंसिंग को कम किया जा सके। अंतिम पूर्व विवो या विवो प्रीक्लिनिकल सेटिंग में इस चरण को करना बोझिल हो सकता है।
सीआरआईएसपीआर/कैटेलिटिक रूप से मृत कैस9 प्रणाली को ईटीआर के लिए आदर्श डीबीडी के रूप में लेते हुए, यह पेपर एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसमें गाइड आरएनए (जीआरएनए) की इन विट्रो स्क्रीन शामिल है, जो कुशल ऑन-टारगेट साइलेंसिंग के लिए ट्रिपल-ईटीआर संयोजन के साथ युग्मित है, इसके बाद शीर्ष हिट ्स के जीनोम-वाइड विशिष्टता प्रोफाइल का मूल्यांकन किया जाता है। यह उम्मीदवार जीआरएनए के प्रारंभिक प्रदर्शनों को होनहार लोगों की एक छोटी सूची में कम करने की अनुमति देता है, जिनकी जटिलता चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक रुचि सेटिंग में उनके अंतिम मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।
जीन निष्क्रियता ने पारंपरिक रूप से सेलुलर और पशु मॉडल दोनों में जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इसके अलावा, पिछले दो दशकों में, जीन थेरेपी के उदय के साथ, इसे गेन-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन1, संक्रामक रोग2, या विकृति के कारण होने वाली बीमारियों के इलाज के लिए संभावित गेम-चेंजिंग दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है, जिसमें एक जीन को चुप कराने सेदूसरे में विरासत में मिले दोष की भरपाई हो सकती है। अंत में, कैंसर इम्यूनोथेरेपी4 और पुनर्योजी चिकित्सा5 के लिए सेल उत्पादों की दक्षता बढ़ाने के लिए सेल फिटनेस और कार्यात्मक नियंत्रण के प्रमुख नियामकों की आनुवंशिक निष्क्रियता का प्रस्ताव किया गया है।
जीन निष्क्रियता को पूरा करने के लिए विभिन्न तकनीकों में से, सबसे आशाजनक में से एक लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग 6,7 है। इस तकनीक के मूल में तथाकथित इंजीनियर ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स (ईटीआर), चिमेरिक प्रोटीन हैं जिनमें एक प्रोग्राम करने योग्य डीएनए-बाइंडिंग डोमेन (डीबीडी) और एपिजेनेटिक दमनकारी फ़ंक्शन के साथ एक प्रभावक डोमेन (ईडी) शामिल है। जिंक फिंगर प्रोटीन (जेडएफपी) 8, ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-जैसे प्रभावक (टीएएलई) 9, या सीआरआईएसपीआर / डीसीएएस 9 10-आधारित डीबीडी को चुनिंदा रूप से ईडी को लक्षित जीन के प्रमोटर / एन्हांसर अनुक्रम से जोड़ने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। एक बार वहां, ईटीआर का ईडी हेटेरोक्रोमैटिन-उत्प्रेरण दमनकारी एपिजेनेटिक निशान जैसे हिस्टोन संशोधनों (एच 3 के 9 11,12 या एच 3 के 2713 मिथाइलेशन, एच 3 या एच 4 डीएसिटिलीकरण14) और सीपीजी डीएनए मिथाइलेशन 15 को लागू करके अपनी साइलेंसिंग गतिविधि करता है।
विशेष रूप से, पूर्व-आरोपण भ्रूण16 में होने वाले अंतर्जात रेट्रोवायरस के स्थायी ट्रांसक्रिप्शनल दमन की आणविक प्रक्रियाओं से प्रेरित, निम्नलिखित ईडी का फायदा उठाने के लिए तीन ईटीआर का एक संयोजन उत्पन्न किया गया है: i) मानव ZNF10 के क्रुपेल-संबद्ध बॉक्स (KRAB) डोमेन; मानव डी नोवो डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 3 ए (डीएनएमटी 3 ए) का उत्प्रेरक डोमेन; और iii) पूर्ण लंबाई वाले मानव डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 3-जैसे (डीएनएमटी 3 एल)। केआरएबी एक संरक्षित दमनकारी डोमेन है जिसे उच्च कशेरुकी17,18 में कई जेडएफपी द्वारा साझा किया जाता है, जिनकी साइलेंसिंग गतिविधि मुख्य रूप से केएपी 119-एक पाड़ प्रोटीन को भर्ती करने की क्षमता पर आधारित होती है जो तब कई अन्य हेटेरोक्रोमैटिन इंड्यूसर ्स20 के साथ बातचीत करती है- जिसमें न्यूक्लियोसोम रीमॉडेलिंग और डिएसिटिलीकरण (एनयूआरडी) कॉम्प्लेक्स 21, एच 3 के 9 हिस्टोन मिथाइलट्रांसफेरेज़ एसईटीडीबी 1 22, और एच 3 के 9 मिथाइलेशन रीडर एचपी 1 23 शामिल हैं। 24, दूसरों के बीच।
DNMT3A सक्रिय रूप से CPG अनुक्रम25 पर डीएनए पर मिथाइल समूहों को स्थानांतरित करता है। DNMT3A की उत्प्रेरक गतिविधि DNMT3L के साथ इसके भौतिक संबंध से बढ़ी है, DNMT3A का एक भ्रूण- और जर्म सेल-प्रतिबंधित पैरालॉग जिसमें मिथाइल समूह हस्तांतरण26,27 के लिए जिम्मेदार उत्प्रेरक डोमेन की कमी है। सीपीजी-समृद्ध क्षेत्रों में डीएनए मिथाइलेशन – जिसे सीपीजी द्वीप (सीजीआई) के रूप में संदर्भित किया जाता है – स्तनधारी जीन के प्रमोटर / एन्हांसर तत्वों में एम्बेडेड आमतौर पर प्रतिलेखन साइलेंसिंग28 से जुड़ा होता है। महत्वपूर्ण रूप से, एक बार जमा होने के बाद, सीपीजी मिथाइलेशन को यूएचआरएफ 1-डीएनएमटी 1-आधारित आणविक परिसर29 द्वारा माइटोसिस के दौरान स्थिर रूप से विरासत में मिला जा सकता है।
लक्ष्य सेल में ईटीआर का स्थिर ओवरएक्प्रेशन समस्याग्रस्त हो सकता है, संभवतः ऑफ-टारगेट गतिविधि के बढ़ते जोखिम ों और समय के साथ उनके शारीरिक लक्ष्य साइटों से अंतर्जात इंटरएक्टर्स के झुकाव के कारण। हालांकि, एकल-ईटीआर मोइटीज की क्षणिक अभिव्यक्ति उच्च दक्षता30 के साथ दीर्घकालिक साइलेंसिंग को प्रेरित करने में विफल हो सकती है, जिससे उनके चिकित्सीय अनुप्रयोग में बाधा उत्पन्न हो सकती है। इसलिए, क्षेत्र में एक मौलिक सफलता यह सबूत थी कि तीन KRAB-, DNMT3A-, और DNMT3L-आधारित ETR का संयोजन तालमेल कर सकता है और, भले ही केवल क्षणिक रूप से सह-वितरित हो, लक्ष्य जीन H3K9 और CPG मिथाइलेशन के प्रमोटर अनुक्रम पर लागू हो। फिर इन्हें माइटोसिस के दौरान कोशिका द्वारा पढ़ा और प्रचारित किया जाता है, जिससे कई मानव और मुराइन सेल लाइनों में आनुवंशिक साइलेंसिंग होती है, साथ ही साथ पूर्व विवो सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाएं30 होती हैं।
ध्यान दें, ईटीआर द्वारा लगाए गए एपिजेनेटिक साइलेंसिंग को लक्षित (जैसे, सीआरआईएसपीआर / डीसीएएस 9-आधारित टीईटी 1 डीएनए डीमिथाइलेज की भर्ती साइलेंट लोकस पर) या फार्माकोलॉजिकल (डीएनए मिथाइलट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर 5-एज़ा का प्रशासन) डीएनए डिमिथाइलेशन30, ईटीआर से संबंधित प्रतिकूल घटनाओं के मामले में एक संभावित एंटीडोट द्वारा मांग पर वापस लाया जा सकता है। तीन KRAB-, DNMT3A-और DNMT3L-आधारित EDs वाले ऑल-इन-वन ETR का भी वर्णन किया गया था, जो प्रोटीन-कोडिंग जीन के बड़े बहुमत के खिलाफ सेल लाइनों31,32 में महत्वपूर्ण साइलेंसिंग क्षमता दिखाते हैं। इसके अलावा, ईटीआर को नियोजित करने वाले कई अध्ययनों ने एक उच्च सुरक्षा प्रोफ़ाइल की सूचना दी, जिसमें नए सीपीजी मिथाइलेशन या क्रोमैटिन पहुंच30,31,32 के परिवर्तन के संदर्भ में कोई बड़ी ऑफ-टारगेट गतिविधि नहीं थी। हालांकि, नैदानिक अनुप्रयोगों से पहले एक नए डिज़ाइन किए गए डीबीडी से लैस ईटीआर की विशिष्टता प्रोफ़ाइल का एक समर्पित विश्लेषण अनुशंसित है।
नैदानिक दृष्टिकोण से, लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) -आधारित वध33 और कृत्रिम न्यूक्लियस-आधारित जीन व्यवधान8 दोनों के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकता है। आरएनएआई के विपरीत, लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग प्रति सेल अपने लक्ष्य के पूर्ण निरस्तीकरण को प्रेरित कर सकती है और दीर्घकालिक चुप्पी सुनिश्चित करने के लिए आवधिक उपचार की आवश्यकता नहीं होती है; जीन व्यवधान के विपरीत, यह डीएनए अनुक्रम को अपरिवर्तित छोड़ देता है, डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) की पीढ़ी से बचता है। डीएसबी तब एपोप्टोसिस और सेल चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित कर सकते हैं, संभावित रूप से एक कार्यात्मक पी 53 मार्ग 34,35 के साथ कोशिकाओं के खिलाफ चयन कर सकते हैं और विशेष रूप से मल्टीप्लेक्स जीन संपादन सेटिंग्स में, क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था35। इसके अलावा, गैर-समरूप-अंत-जुड़ने-मध्यस्थता वाले डीएनए डीएसबी मरम्मत36 के अपरिवर्तनीय मोज़ेक परिणाम को रिले करके, जीन व्यवधान अंतिम परिणामों में से एक के रूप में कार्यात्मक कोडिंग अनुक्रमों में लक्ष्य की इन-फ्रेम मरम्मत से बच नहीं सकता है और, एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के विपरीत, मांग पर मिटाया नहीं जा सकता है।
अंत में, एपिजेनेटिक साइलेंसिंग में लक्षित आनुवंशिक तत्वों की सीमा को आरएनएआई और जीन व्यवधान के लिए पूरी तरह से या कम से कम आंशिक रूप से दुर्दम्य, जैसे गैर-स्थानांतरित नियामक तत्व और गैर-कोडिंग आरएनए30,32 तक विस्तारित करने की क्षमता है। किसी भी लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग एप्लिकेशन के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम लक्ष्य जीन के विभिन्न नियामक अनुक्रमों को कवर करने वाले ईटीआर के एक पैनल को डिजाइन करना और सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वालों की पहचान करना है। परीक्षण किए जाने वाले ईटीआर की संख्या महत्वपूर्ण हो सकती है, जीनोम के बढ़ते हिस्से को देखते हुए जिसेलगातार विकास के तहत प्रोग्राम करने योग्य डीएनए बाइंडिंग प्रौद्योगिकियों द्वारा लक्षित किया जा सकता है। ईटीआर की स्क्रीन को सीधे सेल प्रकार पर निष्पादित करना जिसमें चिकित्सीय रूप से लक्ष्य जीन को शांत करना सबसे प्रासंगिक विकल्प का प्रतिनिधित्व करेगा। हालांकि, संस्कृति में उनके सीमित अस्तित्व और उनकी अक्सर उप-मानक इंजीनियरिंग क्षमता के कारण प्राथमिक कोशिकाओं में उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन तकनीकी रूप से बोझिल हो सकती है। विवो में बड़े पैमाने पर स्क्रीन और भी असंभव हो सकती है।
एक अधिक व्यावहारिक विकल्प में पहले आसानी से इंजीनियर सेल लाइनों में ईटीआर के एक बड़े पैनल की प्रारंभिक स्क्रीनिंग करना शामिल है, और फिर केवल चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक सेल प्रकार में सबसे आशाजनक लोगों को मान्य करना है। एक समानांतर मुद्दा ईटीआर की साइलेंसिंग दक्षता को मापने के लिए एक उपयुक्त रीडआउट का चयन है। आरटी-क्यूपीसीआर, वेस्टर्न ब्लॉट, या एलिसा द्वारा लक्ष्य जीन के प्रतिलेख या प्रोटीन स्तर का सीधे आकलन करना महंगा और समय लेने वाला हो सकता है और इसमें पर्याप्त संवेदनशीलता की कमी हो सकती है, इस प्रकार उच्च-थ्रूपुट स्केल पर उनके आवेदन को सीमित किया जा सकता है। तदर्थ इंजीनियर रिपोर्टर सेल लाइनों की पीढ़ी जिसमें एक फ्लोरोफोरे को लक्ष्य जीन के नियामक अनुक्रमों के ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण के तहत रखा जाता है, एकल-कोशिका स्तर पर और उच्च-थ्रूपुट गति से एपिजेनेटिक साइलेंसिंग को पढ़ने के लिए फ्लो साइटोमेट्री-आधारित दृष्टिकोण के शोषण की अनुमति देता है।
इन सामान्य विचारों के बाद, यह पेपर एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसमें ऑन-टारगेट साइलेंसिंग दक्षता के लिए ईटीआर की इन विट्रो सरणी स्क्रीन शामिल है, इसके बाद शीर्ष हिट ्स की जीनोम-वाइड ऑफ-टारगेट गतिविधि का मूल्यांकन किया जाता है। यह वर्कफ़्लो उम्मीदवार ईटीआर के प्रारंभिक प्रदर्शनों को आशाजनक लोगों की एक छोटी सूची में कम करने की अनुमति देता है, जिनकी जटिलता चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक सेल प्रकार की रुचि में उनके अंतिम मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।
ईटीआर उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जा सकने वाले विभिन्न प्रोग्राम करने योग्य डीबीडी के बीच, यह प्रोटोकॉल सीआरआईएसपीआर / डीसीएएस 9-आधारित तकनीक पर ध्यान केंद्रित करेगा, क्योंकि उच्च-थ्रूपुट पैमाने पर लक्ष्य जीन प्रमोटर को फैलाने वाले जीआरएनए को डिजाइन करने में आसानी होती है। हालांकि, नीचे वर्णित एक ही वैचारिक वर्कफ़्लो को अन्य डीबीडी से लैस ईटीआर की दक्षता और विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए अपनाया जा सकता है।
लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग उन विकारों के इलाज के लिए एक आशाजनक समाधान का प्रतिनिधित्व कर सकती है जो स्थायी जीन निष्क्रियता से लाभान्वित हो सकते हैं, जिसमें गेन-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन1, संक्रामक रोग2, और विकृति के कारण होने वाली बीमारियां शामिल हैं जिनमें एक जीन को चुप कराने से या तो दूसरे जीन में विरासत में मिले दोष की भरपाई हो सकती है3 या दत्तक सेल थेरेपी की पूरी क्षमता को उजागर किया जा सकता है। 5. क्रोमैटिन स्तर पर कार्य करके और कोशिका 7,30,32 द्वारा स्वतः प्रचारित होने से, एपिजेनेटिक साइलेंसिंग लक्ष्य जीन के डीएनए अनुक्रम के विषाक्त परिवर्तनों (जैसे, क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था) और लक्ष्य के आंशिक, क्षणिक साइलेंसिंग से बच सकती है, जो क्रमशः कृत्रिम न्यूक्लियस-आधारित जीन विघटन 8,34,35 और आरएनएआई-आधारित वध 33 की सीमाएं हैं।
किसी भी एपिजेनेटिक साइलेंसिंग प्रोटोकॉल में प्रमुख प्रारंभिक चरणों में से एक ईटीआर को निर्देशित करने के लिए लक्ष्य जीन पर उचित स्थिति की पहचान करना है जो लक्ष्य की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को बंद करने के लिए आवश्यक दमनकारी एपिजेनेटिक निशान जमा करेगा। विभिन्न ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट-समीपस्थ और -डिस्टल नियामक तत्व किसी दिए गए मानव जीन54 के ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट का समर्थन करने के लिए सहमत हो सकते हैं। इसके अलावा, प्रोग्राम करने योग्य डीएनएबाइंडिंग प्रौद्योगिकियों की बढ़ती संख्या के लिए प्रति विशिष्ट नियामक तत्व के विभिन्न लक्ष्य साइटों की पहचान की जा सकती है। इसलिए, प्रोटोकॉल, जैसे कि इंजीनियर सेल लाइनों में यहां वर्णित है, का उपयोग व्यक्तिगत लक्ष्य साइटों और / या जीनोमिक क्षेत्रों को नामांकित करने के लिए किया जा सकता है, जो ईटीआर-मध्यस्थता एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के लिए उत्तरदायी हैं, अंतिम चिकित्सीय सेटिंग में सर्वश्रेष्ठ उम्मीदवारों के बोझिल और समय लेने वाले मूल्यांकन प्रयासों को शुरू करने से पहले। प्रोटोकॉल के कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं को नीचे वर्णित किया गया है।
अंतिम चिकित्सीय लक्ष्य के एक रिपोर्टर सेल लाइन पूर्वानुमान की इंजीनियरिंग।
सेल इंजीनियरिंग प्रोटोकॉल के निरंतर अनुकूलन के बावजूद- लक्ष्य जीन में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए कैसेट कोडिंग डालने और ईटीआर वितरित करने के लिए यहां आवश्यक है- यह नहीं माना जा सकता है कि वे सेल लाइन के लिए पहले से ही उपलब्ध हो सकते हैं जो अंतिम चिकित्सीय लक्ष्य से सबसे अधिक मिलता जुलता है। इस मामले में, विभिन्न शमन रणनीतियों को लागू किया जा सकता है: ए) लक्ष्य सेल लाइन के लिए अभिकर्मक प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए विक्रेताओं द्वारा प्रदान किए गए अनुकूलन किट का लाभ उठाना; बी) अन्य सेल लाइनों पर स्विच करना अभी भी उस लक्ष्य जीन को व्यक्त करता है लेकिन अंतिम चिकित्सीय लक्ष्य के अलावा अन्य ऊतकों से संबंधित है- जिसके लिए इंजीनियरिंग प्रोटोकॉल को बड़े पैमाने पर अनुकूलित किया गया है। यदि ये विकल्प उपलब्ध नहीं हैं, तो कोई अंतिम लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करने वाले प्राथमिक सेल प्रकारों या ऑर्गेनोइड्स पर स्विच करने पर विचार कर सकता है। ईटीआर-आधारित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों और चिकित्सीय अनुप्रयोगों दोनों के लिए एक सामान्य विचार के रूप में, ऐसे परिदृश्य जिनमें लक्ष्य सेल प्रकार के लिए लक्ष्य जीन आवश्यक है, को त्याग दिया जाना चाहिए। ईटीआर द्वारा लगाए गए एक आवश्यक जीन के पूर्ण, दीर्घकालिक साइलेंसिंग से समय के साथ लक्ष्य कोशिकाओं का प्रतिचयन होगा (और, संभावित रूप से, उपचार की विषाक्तता)। इन मामलों में आंशिक लक्ष्य निरस्तीकरण प्रदान करने वाली वैकल्पिक प्रौद्योगिकियां, जैसे आरएनएआई33, को प्राथमिकता दी जाती है।
ईटीआर की ऑन-टारगेट साइलेंसिंग गतिविधि का मूल्यांकन
KRAB, DNMT3A और DNMT3L प्रभावक डोमेन के संयोजन पर आधारित ETR प्रोटीन-कोडिंग जीन के बड़े बहुमत के खिलाफ प्रभावी साबित हुए हैं, जिसमें ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट32 पर केंद्रित लगभग 1 किलोबेस लंबी-अनुमेय लक्ष्यीकरण विंडो है। यह समझने के लिए कि एक अच्छी तरह से प्रदर्शन किया गया एपिजेनेटिक साइलेंसिंग प्रयोग कैसा दिखता है, के -562 कोशिकाओं में बी 2 एम जीन को चुप कराने के तकनीकी विवरण और परिणाम यहां प्रदान किए गए हैं। इसे न केवल के -562 कोशिकाओं के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं द्वारा बल्कि पहली बार ईटीआर-आधारित तकनीक के करीब आने वालों द्वारा शामिल किया जाने वाला एक महत्वपूर्ण सकारात्मक नियंत्रण माना जा सकता है। जैसा कि प्रोटोकॉल में कहा गया है, कृत्रिम न्यूक्लियस (जैसे, CRISPR / Cas9) -आधारित जीन व्यवधान को सेल प्रकार की रुचि में जीन वितरण की दक्षता और लक्ष्य जीन से वंचित कोशिकाओं के फेनोटाइप दोनों के अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में अनुशंसित किया जाता है। CRISPR/dCas9-आधारित ETR के साथ युग्मित होने के लिए GRNA की प्रारंभिक स्क्रीन के बाद, यदि परीक्षण किए गए जीआरएनए में से कोई भी लक्ष्य जीन को स्थायी रूप से चुप करने में सक्षम नहीं है, तो किसी को निम्नलिखित क्रम में विचार करना चाहिए: 1) वितरित किए गए जीआरएनए और ईटीआर की मात्रा में वृद्धि; 2) उनके बीच सहक्रियात्मक प्रभाव ों की तलाश में शीर्ष जीआरएनए के परीक्षण पूल। यदि दीर्घकालिक साइलेंसिंग अभी भी हासिल नहीं की गई है, तो किसी को विचार करना चाहिए: 3) अतिरिक्त जीआरएनए का परीक्षण, जो एपिजेनेटिक साइलेंसिंग को निर्देश देने के लिए अधिक प्रासंगिक साइटों को लक्षित कर सकता है; 4) जेडएफपी8– या टीएएलई9-आधारित डीबीडी प्लेटफार्मों पर स्विच करना, जिसमें लक्ष्य क्रोमैटिन के लिए बेहतर बाध्यकारी क्षमता हो सकती है; 5) क्षणिक से स्थिर में स्विच करना- उदाहरण के लिए, ईटीआर की वायरल वेक्टर-आधारित-अभिव्यक्ति को एकीकृत करना (या तो जीआरएनए या डीसीएएस 9 संलयन निर्माण या सीआरआईएसपीआर / डीसीएएस 9 तकनीक को अपनाते समय दोनों)। चूंकि हमारे समूह ने विकसित किया है, और तीन अलग-अलग ईटीआर30 के सह-वितरण के साथ मजबूत अनुभव है, इसलिए यहां दिखाए गए प्रोटोकॉल और परिणाम इस दृष्टिकोण पर आधारित हैं। हालांकि, एक समान वैचारिक वर्कफ़्लो संभवतः ऑल-इन-वन CRISPR-आधारित सिस्टम32 के लिए लागू किया जा सकता है।
ईटीआर की ऑफ-टारगेट गतिविधि का मूल्यांकन
कई अध्ययनों ने केआरएबी, डीएनएमटी 3 ए और डीएनएमटी 3 एल प्रभावक डोमेन30,31,32 के संयोजन के आधार पर ईटीआर की विशिष्टता के प्रारंभिक इन विट्रो संकेत दिखाए हैं। हालांकि, यदि परीक्षण किए गए जीआरएनए में से, उनमें से कोई भी ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन और / या डी नोवो डीएनए मिथाइलेशन के संदर्भ में संतोषजनक विशिष्टता प्रोफ़ाइल नहीं दिखाता है, तो कोई दो गैर-पारस्परिक रूप से अनन्य रणनीतियों का पीछा कर सकता है: ए) ईटीआर की खुराक को कम करके या वैकल्पिक वितरण प्रणालियों का परीक्षण करके सेल के अंदर ईटीआर के निवास समय को कम करना (और परिणामस्वरूप उनकी संभावित ऑफ-टारगेट गतिविधि)। उदाहरण के लिए, प्लास्मिड की तुलना में, एमआरएनए और प्रोटीन डिलीवरी दोनों से ईटीआर के सेल-एक्सपोज़र समय को कम करने की उम्मीद है और परिणामस्वरूप, ऑफ-टारगेट गतिविधि की संभावना55; बी) हाल ही में सीएएस 9 वेरिएंट पर स्विच करना, प्लेटफॉर्म56 के ऑफ-टारगेट बाइंडिंग को कम करने के लिए अनुकूलित, या वैकल्पिक जेडएफपी8– या टीएएलई9-आधारित डीएनए बाइंडिंग प्रौद्योगिकियों के लिए। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि, नकली-उपचारित नमूनों की तुलना में, जीन साइलेंसिंग की ऑन-टारगेट और ऑफ-टारगेट गतिविधि न केवल डीबीडी के उनके लक्ष्य अनुक्रम से जुड़ने से प्रभावित होती है, बल्कि एपिजेनेटिक प्रभावक डोमेन की संभावित क्षमता से भी प्रभावित होती है जिसे उनके प्राकृतिक, अंतर्जात कोफ़ैक्टर्स द्वारा अन्य लोकी में भर्ती किया जाता है। इसलिए, लक्ष्य सेल में ईटीआर के निवास समय को कम करने से न केवल ऑफ-टारगेट साइटों पर डीबीडी के बंधन की संभावना कम हो सकती है, बल्कि ईटीआर की अंतर्जात कोफ़ैक्टर्स के साथ बातचीत करने की संभावना भी कम हो सकती है, जिसमें ऑन-टारगेट गतिविधि के संदर्भ में विशिष्टता और नुकसान के संदर्भ में संभावित लाभ होते हैं। अंत में, नकली-उपचारित नमूनों की तुलना में, मौन कोशिकाओं में मापा गया कुछ ट्रांसक्रिप्शनल और-कम संभावना-सीपीजी मिथाइलेशन परिवर्तन केवल लक्ष्य जीन के अभाव से प्राप्त किया जा सकता है। इन्हें साइलेंसिंग तकनीक का ऑफ-टारगेट नहीं माना जाता है। उनकी पहचान करने के लिए, प्रयोगात्मक पैनल 8,9,10 में कृत्रिम न्यूक्लियस द्वारा जीन व्यवधान को भी शामिल करना चाहिए। लक्ष्य जीन के कार्यात्मक नुकसान के कारण जैविक परिवर्तन एपिजेनेटिक साइलेंसिंग और इस वैकल्पिक तकनीक के बीच साझा किए जाएंगे।
The authors have nothing to disclose.
लेखक एंजेलो अमाबिल, पाओला कैपासो, इलारिया कैसर्टा, तानिया बाकेगा, ऐलिस रेशिग्ना, वालेरिया मोलिका और डेबोरा सिप्रिया को पूरे वर्षों में एपिजेनेटिक साइलेंसिंग तकनीक विकसित करने के सहयोगी प्रयास के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं; प्रोटोकॉल में वर्णित आरएनए-सेक और एमईडीआईपी-सेक विश्लेषणों की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए डेजन लाजारेविक और फ्रांसेस्का गियानीज़। इस काम को टेलीथॉन फाउंडेशन (टीआईजीईटी अनुदान संख्या एफ 1) और यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 कार्यक्रम (अपग्रेड) से एएल को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। BioRender.com के साथ चित्र बनाए गए हैं।
लेखक का योगदान
एएम, एमएसी, एफजी और एसी ने प्रोटोकॉल के डिजाइन और पांडुलिपि लिखने में योगदान दिया; एस.वी., आई.एम. और डी.सी. ने प्रोटोकॉल के जैव सूचना विज्ञान अनुभागों को डिजाइन किया और पांडुलिपि को संशोधित किया; एएम और ए.एल. ने प्रोटोकॉल डिजाइन किया, कल्पना की और सभी लेखकों के इनपुट के साथ पांडुलिपि लिखी।
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |