JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Immunologia e infezioni

Fagmedieret genmanipulation af borreliose Spirochete Borrelia burgdorferi

Published: September 28, 2022
doi:
10.3791/64408
1Department of Biomedical Sciences,Quinnipiac University

Summary

Bakteriofagens evne til at flytte DNA mellem bakterieceller gør dem til effektive værktøjer til genetisk manipulation af deres bakterielle værter. Præsenteret her er en metode til at inducere, genoprette og bruge φBB-1, en bakteriofag af Borrelia burgdorferi, til at transducere heterologt DNA mellem forskellige stammer af Lyme-sygdommen spirochete.

Abstract

Introduktion af fremmed DNA i spirochete Borrelia burgdorferi er næsten udelukkende opnået ved transformation ved hjælp af elektroporation. Denne proces har især lavere effektivitet i borreliose spirochete i forhold til andre, bedre karakteriserede gramnegative bakterier. Transformationshastigheden er meget afhængig af at have koncentrerede mængder DNA af høj kvalitet fra specifikke baggrunde og er underlagt betydelig belastning-til-stamme-variabilitet. Alternative midler til at indføre fremmed DNA (dvs. shuttlevektorer, fluorescerende journalister og antibiotikaresistensmarkører) i B. burgdorferi kunne være en vigtig tilføjelse til armamentarium af nyttige værktøjer til genetisk manipulation af borreliose spirochete. Bakteriofag er blevet anerkendt som naturlige mekanismer til bevægelse af DNA blandt bakterier i en proces kaldet transduktion. I denne undersøgelse er der udviklet en metode til at bruge den allestedsnærværende borreliale φBB-1 til at transducere DNA mellem B. burgdorferi-celler med både samme og forskellige genetiske baggrunde. Det transducerede DNA omfatter både borrelialt DNA og heterologt DNA i form af små shuttlevektorer. Denne demonstration antyder en potentiel anvendelse af fagmedieret transduktion som et supplement til elektroporation til genetisk manipulation af borreliose spirochete. Denne rapport beskriver metoder til induktion og oprensning af φBB-1 fra B. burgdorferi, brugen af denne i transduktionsassays og udvælgelse og screening af potentielle transduktanter.

Introduction

Udviklingen af værktøjer til genetisk manipulation af spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tilføjet umådelig værdi til forståelsen af borreliosens natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har et usædvanligt komplekst genom bestående af et lille lineært kromosom og både lineære og cirkulære plasmider 5,6. Spontant plasmidtab, intragen omlejring (bevægelse af gener fra et plasmid til et andet inden for samme organisme) og horisontal genoverførsel (HGT, bevægelse af DNA mellem to organismer) har givet anledning til en svimlende mængde genetisk heterogenitet blandt B. burgdorferi (for et eksempel, se Schutzer et al.7). De resulterende genotyper (eller “stammer”) er alle medlemmer af samme art, men har genetiske forskelle, der påvirker deres evne til at overføre til og inficere forskellige pattedyrværter 8,9,10,11. I denne rapport vil udtrykket “stamme” blive brugt til at henvise til B. burgdorferi med en særlig naturligt afledt genetisk baggrund; Udtrykket “klon” vil blive brugt til at henvise til en stamme, der er blevet genetisk modificeret til et bestemt formål eller som følge af eksperimentel manipulation.

Den molekylære værktøjskasse, der er tilgængelig til brug i B. burgdorferi, inkluderer valgbare markører, genreportere, shuttlevektorer, transponmutagenese, inducerbare promotorer og modvalgbare markører (for en gennemgang, se Drektrah og Samuels12). Den effektive anvendelse af disse metoder kræver kunstig introduktion af heterologt (fremmed) DNA i en B. burgdorferi-stamme af interesse. I B. burgdorferi opnås indførelsen af heterologt DNA næsten udelukkende via elektroporation, en metode, der udnytter en puls af elektricitet til at gøre en bakteriemembran forbigående gennemtrængelig for små stykker DNA, der indføres i mediet1. Størstedelen af cellerne (anslået til at være ≥99,5%) dræbes af pulsen, men de resterende celler har en høj frekvens for at bevare det heterologe DNA13. Selvom det anses for at være blandt de mest effektive metoder til at indføre DNA i bakterier, er frekvensen af elektroporation i B. burgdorferi meget lav (fra 1 transformerende i 5 × 104 til 5 × 106 celler)13. Hindringerne for at opnå højere transformationsfrekvenser synes at være både tekniske og biologiske. Tekniske barrierer for en vellykket elektroporation af B. burgdorferi omfatter både mængden af DNA (>10 μg), der er nødvendig, og spirocheternes krav om at være i nøjagtig den korrekte vækstfase (midt i loggen, mellem 2 × 10 7 celler · ml – 1 og 7 × 107 celler · ml – 1) ved fremstilling af elektrokompetente celler12,13. Disse tekniske barrierer kan dog være lettere at overvinde end de biologiske barrierer.

Lyme sygdomsforskere erkender, at B. burgdorferi kloner kan opdeles i to brede kategorier med hensyn til deres evne til at blive manipuleret genetisk13,14. Laboratorietilpassede isolater med høj passage transformeres ofte let, men har normalt mistet de plasmider, der er afgørende for infektivitet, opfører sig på en fysiologisk afvigende måde og er ikke i stand til at inficere en pattedyrvært eller fortsætte inden for en flåtvektor12,13. Mens disse kloner har været nyttige til at dissekere spirochetens molekylærbiologi i laboratoriet, er de af ringe værdi for at studere spirocheten inden for den biologiske kontekst af den enzootiske cyklus. Lavpassage infektiøse isolater opfører sig derimod på en fysiologisk måde, der afspejler en infektiøs tilstand og kan fuldføre den infektiøse cyklus, men er normalt genstridige over for indførelsen af heterologt DNA og er derfor vanskelige at manipulere til undersøgelse12,13. Vanskeligheden ved at omdanne isolater med lav passage er relateret til mindst to forskellige faktorer: (i) isolater med lav passage klumper sig ofte tæt sammen, især under de høje densitetsforhold, der kræves til elektroporation, og blokerer således mange celler fra enten fuld anvendelse af den elektriske ladning eller adgang til DNA’et i mediet13,15; og (ii) B. burgdorferi koder for mindst to forskellige plasmidbårne begrænsningsmodifikationssystemer (R-M), der kan gå tabt i højpassageisolater14,16. R-M-systemer har udviklet sig til at tillade bakterier at genkende og eliminere fremmed DNA17. Faktisk har flere undersøgelser i B. burgdorferi vist, at transformationseffektiviteten øges, når kilden til DNA’et er B. burgdorferi snarere end Escherichia coli13,16. Desværre er erhvervelse af den nødvendige høje koncentration af DNA til elektroporation fra B. burgdorferi et dyrt og tidskrævende perspektiv. En anden potentiel bekymring ved elektropotering og valg af isolater med lav passage er, at processen ser ud til at favorisere transformanter, der har mistet det kritiske virulensassocierede plasmid, lp2514,18,19; således kan selve handlingen med genetisk manipulation af lavpassage B. burgdorferi-isolater via elektroporation vælge for kloner, der ikke er egnede til biologisk relevant analyse inden for den enzootiske cyklus20. I betragtning af disse problemer kunne et system, hvor heterologt DNA kunne elektrotransformeres til højpassage B. burgdorferi kloner og derefter overføres til lavpassage infektiøse isolater ved en anden metode end elektroporation være en velkommen tilføjelse til den voksende samling af molekylære værktøjer, der er tilgængelige til brug i borrelia spirochete.

Ud over transformation (optagelse af nøgent DNA) er der to andre mekanismer, hvormed bakterier regelmæssigt optager heterologt DNA: konjugation, som er udveksling af DNA mellem bakterier i direkte fysisk kontakt med hinanden og transduktion, som er udveksling af DNA medieret af en bakteriofag21. Faktisk er bakteriofagens evne til at mægle HGT blevet brugt som et eksperimentelt værktøj til dissekering af de molekylære processer inden for en række bakteriesystemer22,23,24. B. burgdorferi er ikke naturligt kompetent til optagelse af nøgent DNA, og der er få beviser for, at B. burgdorferi koder for det apparat, der er nødvendigt for at fremme en vellykket bøjning. Tidligere rapporter har imidlertid beskrevet identifikationen og den foreløbige karakterisering af φBB-1, en tempereret bakteriofag af B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 pakker en familie på 30 kb plasmider fundet i B. burgdorferi25; Medlemmerne af denne familie er blevet udpeget CP32s. I overensstemmelse med en rolle for φBB-1 ved deltagelse i HGT blandt B. burgdorferi-stammer rapporterede Stevenson et al. en identisk cp32 fundet i to stammer med ellers forskellige cp32’er, hvilket tyder på en nylig deling af denne cp32 mellem disse to stammer, sandsynligvis via transduktion29. Der er også tegn på signifikant rekombination via HGT blandt cp32’erne i et ellers relativt stabilt genom30,31,32,33. Endelig er φBB-1’s evne til at transducere både cp32’er og heterologt shuttlevektor-DNA mellem celler af samme stamme og mellem celler med to forskellige stammer tidligere blevet påvist27,28. I betragtning af disse resultater er φBB-1 blevet foreslået som et andet værktøj, der skal udvikles til dissektion af molekylærbiologien af B. burgdorferi.

Målet med denne rapport er at detaljere en metode til inducering og rensning af φBB-1 fra B. burgdorferi samt give en protokol til udførelse af et transduktionsassay mellem B. burgdorferi-kloner og udvælgelse og screening af potentielle transduktanter.

Protocol

Alle eksperimenter ved hjælp af rekombinant DNA og BSL-2 organismer blev gennemgået og godkendt af Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee. 1. Forberedelse af B. burgdorferi-kultur til produktion af φBB-1 Forbered Barbour-Stoenner-Kelly medium suppleret med 6,6% varmeinaktiveret normalt kaninserum (BSK)15. For 1 liter 1x BSK kombineres komponenterne i tabel 1 i 900 ml vand, pH justeres til 7,6 med 1…

Representative Results

Brugen af bakteriofag til at flytte DNA mellem lettere transformerbare B. burgdorferi-stammer eller kloner, der er genstridige over for elektrotransformation, repræsenterer et andet værktøj til fortsat molekylær undersøgelse af determinanterne for borreliose. Transduktionsassayet beskrevet heri kan ændres efter behov for at lette bevægelsen af DNA mellem eventuelle kloner af interesse ved hjælp af enten et eller to antibiotika til udvælgelse af potentielle transduktanter. Transduktionen af både prophag…

Discussion

Anvendelsen af transduktion kunne repræsentere en metode til at overvinde i det mindste nogle af de biologiske og tekniske barrierer forbundet med elektrotransformationen af B. burgdorferi 1,4,13,37. I mange systemer kan bakteriofag flytte værts-DNA (ikke-prophage) mellem bakterieceller ved enten generaliseret eller specialiseret transduktion 22,23,24,49,50.<s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatteren ønsker at takke Shawna Reed, D. Scott Samuels og Patrick Secor for deres nyttige diskussion og Vareeon (Pam) Chonweerawong for deres tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af Institut for Biomedicinsk Videnskab og fakultetets forskningsbevillinger til Christian H. Eggers fra School of Health Sciences ved Quinnipiac University.

Materials

1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066 (2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195 (2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131 (1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331 (2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi.. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61 (2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165 (2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994 (2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298 (1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S., Saier, M. H., Garcia-Lara, J. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. , 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. . Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

Tags

Phage TransductionBorrelia BurgdorferiLyme DiseaseBiologia MolecolareGenetic ManipulationPhage ProductionPEG PrecipitationAntibiotic Selection
check_url/it/64408?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image