啮齿动物眼睛的显微解剖
Summary
本文提出了一种啮齿动物眼部显微解剖的方案。该过程涉及眼球与眼球膜（即第三眼睑）的剜除。然后是后眼杯和前眼杯的分离。
Abstract
啮齿动物眼的眼部显微解剖涉及将去核眼球与附着的眼膜或第三眼睑分割，以获得前眼罩和后眼罩。使用这种技术，可以获得眼睛的子部分，包括角膜组织、神经组织、视网膜色素上皮 （RPE） 组织和晶状体，用于特定眼组织的整片、冷冻切片和/或单细胞悬液。第三眼睑的存在具有独特而显着的优势，因为它有利于维持眼睛的方向，这对于在任何局部干预后了解眼睛生理学或涉及与眼睛空间地形相关的眼部分析的研究非常重要。
在这种方法中，我们通过小心而缓慢地切开眼外肌并切断视神经，将眼窝处的眼球与第三眼睑一起去掉。用微刀片刺穿眼球角膜缘。切口被用作切口，允许通过切口点插入微型剪刀来沿着角膜巩膜连接处切割。沿圆周进行小而连续的切割，直到杯子分离。这些可以通过使用Colibri缝合钳轻轻剥离神经视网膜的半透明层来进一步解剖，以获得神经视网膜和RPE层。此外，从外围垂直于视中心进行三/四个等距切口，直到到达视神经。这将半球形杯子打开成小花形状，使它们平坦并可以轻松安装。该技术已在我们的实验室中用于角膜整体安装和视网膜切片。第三眼睑的存在描绘了鼻颞方向，这允许研究移植后的各种细胞治疗干预措施，因此，对于此类研究中的可视化和准确表示至关重要的靶向生理验证。
Introduction
眼部解剖是眼科研究中的一项重要技术，它允许研究人员进入眼睛的节段进行有针对性的研究。以前，眼部研究人员依靠患病个体的眼组织进行研究。然而，多年来眼科啮齿动物模型1 的菌株数量逐渐增加，减少了对人类眼组织的需求。这些小鼠品系使人们对眼部疾病和干预措施有了更深入的了解。然而，它们也产生了对眼部显微解剖创新技术的需求。小尺寸和有限的操作区域严重限制了对眼亚部分的有效访问。此外，由于后眼罩和前眼杯的细胞组装均匀，因此很难在解剖后进行有针对性的干预。目前的激光2 和外科显微解剖3，4 的显微解剖技术不足以满足眼科研究的这种要求。激光显微解剖在单细胞分析中非常有效，但特定组织需要在激光手术前进行显微解剖2。该技术可以从预先解剖的组织中分离出感兴趣的小区域以进行分子分析。因此，该技术不适用于制备整体安装或分离轴向堆积的眼层以获得最佳可视化效果。
手术方法是使用最广泛的技术;该方法涉及通过视神经5固定眼睛，然后进行解剖。这种做法很艰巨，可能会损害任何脆弱的组织，因为球眼在解剖过程中继续移动。尽管该技术有利于分离视网膜层的各个部分，但该技术无法在解剖时划定组织的空间方向。
在解剖过程中，保持附着的萤火膜或第三眼睑的存在（图1）具有独特而显着的优势。在这种方法中，首先，用第三眼睑去眼球。然后，使用第三眼睑固定眼睛6（图2A）。随后通过角膜缘刺穿眼球并使用切口作为切入点（图2B，C）。然后，通过沿前后圆周切割来分离眼罩（图2D-G）。通过进一步解剖后眼罩，可以识别神经视网膜的半透明层并轻轻剥离。然后在获得的半球形前杯和后杯中进行三个或四个等距切割，这使得这些花形杯子平放在滑块上（图2H）。
第三个眼睑有助于在解剖过程中轻松有效地处理，从而确保在进入各个眼层和生产整体时对组织的损害最小。此外，第三眼睑的存在有助于在可视化过程中定位和检查局部干预。
在我们的实验室中，该程序已在任何性别的 P28 的 CBA/J 或 rd1 小鼠品系上进行。该程序可以对动物的任何品系，年龄或性别进行，并且根据这些特征没有偏差。
这些动物是从商业来源采购的（见 材料表），并在国家免疫学研究所（NII）的小动物设施（SAF）进行维护。他们被关在单独的通风笼子（IVC）中， 并随意获得 酸化的高压灭菌水和食物。它们保持在21-23°C，光照/黑暗循环为14小时/ 10小时。
下面给出的是用于小鼠眼睛微解剖的改良手术方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于啮齿动物眼睛的体积小和球形，已经发现眼部显微解剖是一项艰巨的任务，并且啮齿动物眼睛需要创新技术才能有效处理8。
在目前演示的方法中，通过附有第三眼睑获得去核小鼠眼球，以便有效且易于处理。使用第三眼睑，眼球可以完全固定，这使得解剖可以轻松进行，误差最小。此外，第三眼睑的存在描绘了眼睛子部分的方向。因此，用第三眼睑解…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
美国加州大学戴维斯分校细胞生物学和人体解剖学系的Alaknanda Mishra博士在新德里国家免疫学研究所培训了我们这种方法。这项工作得到了印度政府生物技术部向新德里国家免疫学研究所提供的核心赠款的支持。P.S.被生物技术系授予研究奖学金。
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Riferimenti
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