Avbildning av åldrande cochlea med fluorescensmikroskopi

Summary

Ett ljusarkmikroskop utvecklades för att avbilda och digitalisera hela cochlea.

Abstract

Dövhet är den vanligaste sensoriska nedsättningen, som påverkar cirka 5% eller 430 miljoner människor världen över enligt Världshälsoorganisationen¹. Åldrande eller presbycusis är en primär orsak till sensorineural hörselnedsättning och kännetecknas av skador på hårceller, spiralganglionneuroner (SGN) och stria vascularis. Dessa strukturer ligger i cochlea, som har en komplex, spiralformad anatomi av membranvävnader suspenderade i vätska och omgiven av ben. Dessa egenskaper gör det tekniskt svårt att undersöka och kvantifiera histopatologiska förändringar. För att möta detta behov utvecklade vi ett ljusarkmikroskop (TSLIM) som kan avbilda och digitalisera hela cochlean för att underlätta studier av struktur-funktionsförhållanden i innerörat. Väljusterade seriella sektioner av hela cochlean resulterar i en stapel bilder för tredimensionell (3D) volymåtergivning och segmentering av enskilda strukturer för 3D-visualisering och kvantitativ analys (dvs. längd, bredd, yta, volym och antal). Cochleae kräver minimala bearbetningssteg (fixering, avkalkning, uttorkning, färgning och optisk rensning), som alla är kompatibla med efterföljande högupplöst avbildning genom skanning och transmissionselektronmikroskopi. Eftersom alla vävnader finns i staplarna kan varje struktur bedömas individuellt eller i förhållande till andra strukturer. Dessutom, eftersom avbildning använder fluorescerande sonder, kan immunohistokemi och ligandbindning användas för att identifiera specifika strukturer och deras 3D-volym eller distribution inom cochlean. Här använde vi TSLIM för att undersöka cochleae från åldrade möss för att kvantifiera förlusten av hårceller och spiralganglionneuroner. Dessutom användes avancerade analyser (t.ex. klusteranalys) för att visualisera lokala minskningar av spiralganglieneuroner i Rosenthals kanal längs dess 3D-volym. Dessa tillvägagångssätt visar TSLIM-mikroskopins förmåga att kvantifiera struktur-funktionsförhållanden inom och mellan cochleae.

Introduction

Cochlea är det perifera sensoriska organet för hörsel hos däggdjur. Den har en komplex spiralanatomi av upprepande sensoriska och stödjande celler som är anatomiskt specialiserade för att upptäcka ljudvibrationer och överföra dem till hjärnan för uppfattningen av hörsel. De viktigaste sensoriska elementen är de inre och yttre hårcellerna och deras innerverande nervfibrer vars cellkroppar utgör spiralganglion, som ligger i Rosenthals kanal (figur 1). Dessa sensoriska och neurala strukturer är tonotopiskt arrangerade så att högfrekventa ljud transduceras i cochleabasen och lågfrekventa ljud transduceras i cochlea apex². En anatomisk karta över denna sensoriska cellfördelning längs spirallängden på det stödjande basilarmembranet kallas cytocochleogram³ och kan jämföras med hörselnedsättning som en funktion av frekvensen som avbildas i ett audiogram.

Den membranösa labyrinten i cochlean, som är omgiven av tätt ben, gör det tekniskt svårt att undersöka mer än en cochleastruktur åt gången. Därför är motiveringen för att utveckla ett ljusarkmikroskop att producera välinriktade seriella sektioner av hela cochlean så att alla cochleastrukturer kan undersökas i förhållande till varandra i 3D-rekonstruktioner. Voie et ^al.4 och Voie och Spelman⁵ designade det första ljusarkmikroskopet, kallat OPFOS-mikroskop (orthogonal plane fluorescence optical sectioning), för att optiskt snitta hela cochlean. Detta mikroskop utvecklades dock aldrig kommersiellt; så vårt mål var att konstruera ett ljusarkmikroskop som kallas ett tunt arklaserbildmikroskop (TSLIM; Figur 2). Design- och konstruktionsdetaljerna för TSLIM har tidigare publicerats⁸. TSLIM gjorde flera förbättringar jämfört med OPFOS, inklusive användning av en digitalkamera i svagt ljus kontra en CCD-kamera för bildinsamling, optiskt kodade mikropositioners för exakt och reproducerbar rörelse av provet genom ljusarket, användning av en kommersiellt tillgänglig, optiskt klar provkammare och rhodaminfärgning i etanol snarare än i rensningslösningen för att förhindra fläckutfällning i vävnaden. Kommersiell utveckling av ljusarkmikroskop som SPIM⁶ har fokuserat på högupplöst avbildning av levande, små transparenta prover men är olämpliga för hela cochleabilder eftersom de saknar tillräckligt arbetsavstånd. En översyn av utvecklingen av andra ljusarkmikroskop publicerades av Santi⁷. TSLIMs främsta fördel jämfört med andra histologiska metoder för att undersöka cochlean är att optiskt snitta vävnader för 3D-rekonstruktion samtidigt som provets integritet bevaras så att den kan användas med andra histologiska metoder. En annan fördel med TSLIM-avbildning är att endast ett tunt ljusark som produceras av en laser exponeras för vävnaden, jämfört med exponering för hela vävnadstjockleken för lasern som vid konfokalmikroskopi. Vävnadsrensning för att minimera ljusspridning och det faktum att endast en liten del av vävnaden utsätts för lasern resulterar i minimal fluorokromblekning (fotoblekning) med laseravbildning av ljusplåt. Processen med fixering, uttorkning och rensning förändrar emellertid morfologin hos cochleära strukturer och resulterar i vävnadskrympning jämfört med levande vävnad. Den faktiska mängden vävnadskrympning som uppstår bestämdes inte.

TSLIM utvecklades av Shane Johnson och åtta tyska optikstudenter (se Erkännanden). TSLIM-konstruktionsdetaljer tillhandahölls av Santi et ^al.8 och en skanningsversion (sTSLIM) av Schröter et ^al.9. TSLIM fungerar som en icke-destruktiv mikrotom för optiskt sektionsprover och som ett mikroskop för att samla 2D-seriella sektioner genom hela bredden och tjockleken på cochlean. TSLIM kan avbilda både små (mm) och stora (cm), tjocka exemplar. Linser är luftmonterade för att möjliggöra långa arbetsavstånd med insamlingsmål på 1x och 2x på ett dissektionsmikroskop. Dissektionsmikroskopet har också zoomoptik som gör att TSLIM kan lösa subcellulära och synaptiska strukturer på celler. TSLIM är utrustad med både en blå (473 nm) och grön (532 nm) laser för belysning som gör det möjligt att använda en mängd olika fluorescerande sonder för avbildning. Målet med TSLIM är att producera välanpassade 2D-optiska sektioner genom en hel cochlea för en komplett digital rekonstruktion av cochleavävnader. Eftersom det är en fluorescerande metod kan ligander och immunhistokemi också användas för att identifiera specifika cochleära strukturer.

Ursprungligen användes en cylindrisk lins för att producera två motsatta Gaussiska ljusark, men det producerade absorptionsbildningsartefakter. På grund av arbetet av Keller et ^al.10 ersattes den fasta cylindriska linsen med en skanningsgalvanometerspegel för att producera ljusarket⁹. Dessutom, eftersom ljusarkets mitt är det tunnaste vid strålmidjan, produceras sTSLIM 2D-bilder genom att samla in en sammansättning av X-axelkolumner med data över provets bredd (figur 3). Denna metod beskrevs först av Buytaert och Dircks¹¹. TSLIM anpassad programvara för att köra och samla bilder utvecklades med hjälp av ett grafiskt program för instrumentstyrning. Ljusarket färdas genom provet och belyser ett fluorescerande plan i vävnaden. Detta fluorescerande plan projiceras ortogonalt genom det transparenta provet och samlas in av ett dissektionsmikroskop. Optiskt kodade mikrolägesställare gör det möjligt att skanna genom strålmidjan i X-axeln för att samla in en enda sammansatt 2D-bild och därefter flyttar Z-axelns mikropositionerare provet till ett djupare plan i vävnaden för att få en stapel seriella, snittade 2D-bilder (Video 1, figur 4). En stapel med translationella bilder samlas in genom hela cochleans bredd, tjocklek och längd, och sömnad av bilder krävs inte (Video 2). Bildstacken överförs till en annan dator och laddas in i ett 3D-renderingsprogram för 3D-rekonstruktion och kvantifiering. Bildstaplarna innehåller all digital information om en cochleans morfologi vid mikroskopets upplösning. Men om en högre upplösning krävs kan den intakta cochlean bearbetas ytterligare med destruktiva histologiska metoder såsom mikrotomsektionering, skanning och transmissionselektronmikroskopi.

3D-renderingsprogrammet används för att segmentera olika cochleära strukturer för 3D-rendering och kvantitativ analys. För segmentering spåras varje struktur i varje 2D-bild av stapeln med en annan färg av en grafikplatta och penna (figur 5). Hittills har 20 olika cochleastrukturer segmenterats (figur 6). Efter segmentering kan en mängd olika 3D-analyser utföras. Till exempel kan 3D-renderingsprogramvara praktiskt taget resektion av cochlea i vilket plan som helst längs strukturens centroid. Video 3 visar sektionering tangentiell till Corti-organet, vilket avslöjar hårcellerna längs basilarmembranets längd. Denna process kräver först manuell segmentering av strukturen av intresse. Därefter beräknas strukturens centroid baserat på minsta kvadratpassningen av splinepunkter placerade längs mitten av strukturen från dess bas till dess topp, vilket möjliggör en approximation av strukturens längd (Video 4). En liknande process som kallas skelettisering kan användas för att visualisera strukturens radiella bredd längs dess längd med hjälp av en färgkarta (Video 4). Den totala volymen för varje struktur beräknas av programmet efter segmentering, men relativa avstånd kan också kvantifieras och visualiseras med färgkartor i en 3D-renderingsprogramvara (figur 7). Segmenterade strukturer kan också exporteras för att producera förstorade, solida plastmodellrenderingar (figur 8). Dessutom kan halvautomatisk cellräkning också utföras med hjälp av 3D-renderingsprogramvara (figur 9). Immunhistokemi och ligandbindning kan användas för att färga specifika cochleastrukturer och dessa strukturer kan isoleras från andra cochleära strukturer för morfometrisk bedömning, såsom framställning av ett cytocochleogram (figur 10). Längd, bredd, yta, volym och antal för alla cochleastrukturer kan bestämmas från 3D-modellerna, vilket gör detta tillvägagångssätt idealiskt för att kartlägga cochleaskador på funktionsnedsättningar. Specifikt kan cochleaskador på grund av åldrande, bullerinducerat trauma eller andra förolämpningar visas och kvantifieras i 3D-cochlearekonstruktioner från 2D-optiska sektioner. När en cochlea har digitaliserats finns det många avbildningsalgoritmer som kan användas för att bedöma cochleaskador på vilken vävnad som helst i cochlean i det anatomiska registret till andra cochleavävnader.

Protocol

Alla förfaranden och användningen av levande djur har granskats och godkänts (protokoll-ID # 2010-38573A) av University of Minnesota Institutional Care and Use Committee (IACUC) och utredare som använder dessa djur har grundligt utbildats och testats av veterinärerna Research Animal Resources (RAR) innan de har tillgång till djuranläggningarna. Både manliga och kvinnliga möss användes i denna studie. 1. Borttagning av cochlea för fixering och vävnadsbehandling för bildbehand…

Representative Results

Eftersom temat för detta specialnummer är att avbilda effekterna av åldrande i cochlean, kommer en ung (3 månader gammal, HS2479, CBA-stammus) och åldrad (23 månader gammal, HS2521, C57 stammus) cochleae att användas som exempel. Det bör noteras att TSLIM kan avbilda en mängd olika prover, inklusive cochleae från människor, däggdjur, andra gnagare och fisk, liksom andra organ som hjärnan. Johnson et al. 13 publicerade en artikel om SGN hos unga (3 veckor ga…

Discussion

Optisk snittning med ljusarkmikroskopi för undersökning av cochleastrukturer är inte mekaniskt destruktiv som andra mer traditionella histologiska metoder, och det ger en fullständig digital bild av cochleastrukturer i förhållande till varandra. Tidigare metoder såsom ytprepareringar av organet i Corti¹⁴ gav en karta över hårcellsförlust längs basilarmembranets längd, men SGN-förlusten kunde inte bedömas eftersom vävnaden hade dissekerats bort för att avslöja Corti-organet. Altern…

Materials

Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423