عزل بصيلات ما قبل البقرية الصغيرة من المبيض البقري باستخدام مزيج من التجزئة والتجانس والترشيح التسلسلي

Summary

يتطلب التقدم في دراسة تكوين الجريب قبل الكثبان طرقا فعالة لعزل الجريب عن المبايض المفردة. يظهر هنا بروتوكول ميكانيكي مبسط لعزل الجريب عن المبايض البقري باستخدام مروحية الأنسجة والخالط. تسمح هذه الطريقة بجمع عدد كبير من بصيلات preantral القابلة للحياة من مبيض واحد.

Abstract

يعد فهم العملية الكاملة لتكوين الجريب في الثدييات أمرا بالغ الأهمية لتحسين تقنيات الإنجاب المساعدة في الماشية والبشر والأنواع المهددة بالانقراض. اقتصرت الأبحاث في الغالب على الجريبات الغارية والكبيرة بسبب صعوبة عزل البصيلات قبل الغريبة الأصغر ، خاصة في الثدييات الكبيرة مثل أنواع الأبقار. يقدم هذا العمل نهجا فعالا لاسترداد أعداد كبيرة من الجريبات الصغيرة من مبيض بقري واحد. تم تقطيع قشرة المبيضين البقري الفردي إلى مكعبات 500 ميكرومتر باستخدام مفرمة الأنسجة ومتجانسة لمدة 6 دقائق عند 9000-11000 دورة في الدقيقة باستخدام مسبار 10 مم. تم فصل الحطام الكبير عن التجانس باستخدام قطعة قماش جبن ، يليه ترشيح تسلسلي من خلال مصافي خلايا 300 ميكرومتر و 40 ميكرومتر. تم شطف المحتويات المحتفظ بها في مصفاة 40 ميكرومتر في طبق بحث ، حيث تم تحديد البصيلات وجمعها في قطرة من المتوسط. تم اختبار صلاحية البصيلات التي تم جمعها عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق. تتيح هذه الطريقة عزل عدد كبير من البصيلات الصغيرة القابلة للحياة من مبيض بقري واحد في حوالي 90 دقيقة. الأهم من ذلك ، أن هذه الطريقة ميكانيكية بالكامل وتتجنب استخدام الإنزيمات لفصل الأنسجة ، مما قد يؤدي إلى تلف البصيلات. يمكن استخدام البصيلات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول للتطبيقات النهائية مثل عزل الحمض النووي الريبي ل RT-qPCR ، والتموضع المناعي لبروتينات معينة ، والثقافة في المختبر .

Introduction

جريبات المبيض هي الوحدات الوظيفية للمبيض ، المسؤولة عن إنتاج الأمشاج (البويضة) وكذلك الهرمونات الضرورية للوظيفة الإنجابية والصحة العامة. تتشكل بصيلات بدائية في المبيض أثناء نمو الجنين أو في فترة حديثي الولادة اعتمادا على الأنواع¹ ، وتشكل احتياطي مبيض الأنثى. يبدأ النمو المسامي بتنشيط البصيلات البدائية التي تغادر بركة الراحة وتدخل مرحلة النمو. تكوين الجريبات قبل الغار ، الذي يشمل جميع مراحل الجريب قبل تطور الغار ، هو عملية ديناميكية للغاية تتطلب تغييرات مورفولوجية واستقلابية متزامنة في البويضة والخلايا الحبيبية المحيطة بها ، مدفوعة باتصال وثيق بين هذين النوعين من الخلايا ^2,3. تشكل الجريبات قبل النطرية غالبية الوحدات المسامية الموجودة في المبيض في^{أي وقت 4}. يقدر التطور خلال المراحل السابقة لتكوين الجريبات بعدة أسابيع أطول من التطور الغاري ^5,6 ، وهذه المرة ضرورية للخلايا البيضية والجسدية لاكتساب النضج الكافي لدخول المرحلة النهائية من التطور (أي المرحلة الغارية) ، والاستعداد للإباضة والإخصاب والتطور الجنيني 7,8,9.

يأتي الكثير من المعرفة الحالية حول تكوين جريبات المبيض قبل الحلق من نماذج الفئران¹⁰،¹¹،¹²،^{13 ،} ويرجع ذلك جزئيا إلى سهولة استعادة عدد كبير من هذه البصيلات من مبيض أصغر وأقل ليفية. على الرغم من أن التقارير عن عزل أعداد كبيرة من الجريبات قبل الجريبات من المبيضين البقري تعود إلى ما يقرب من 30 عاما¹⁴ ، إلا أن الفهم الأكثر اكتمالا حول العمليات التي تنظم تطور هذه البصيلات في المراحل المبكرة ظل غير محقق ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى عدم وجود طرق محسنة وفعالة وقابلة للتكرار لاسترداد أعداد كافية من بصيلات ما قبل البكرات القابلة للحياة ، خاصة في المراحل المبكرة من التطور. مع الاهتمام المتزايد بالحفاظ على احتياطي المبيض للاستخدام المستقبلي في المساعدة على الإنجاب في البشر ، تصبح الأبقار نموذجا جذابا بسبب بنية المبيض الأكثر تشابها¹⁵. ومع ذلك ، فإن المبيض البقري أكثر ثراء بشكل ملحوظ في الكولاجين مقارنة بمبيض الفأر¹⁶ ، مما يجعل العزل الميكانيكي باستخدام الطرق الموصوفة للفأر غير فعال للغاية. تشمل الجهود المبذولة لتوسيع تقنيات الحفاظ على الخصوبة النمو الكامل في المختبر للجريبات قبل الغريبة إلى المرحلة الغارية ، يليها النضج في المختبر (IVM) للبويضات المغلقة ، والتخصيب في المختبر (IVF) ، وإنتاج الأجنة ونقلها¹⁷. حتى الآن ، تم تحقيق هذه العملية برمتها فقط في الفئران¹⁸. في الماشية ، يقتصر التقدم نحو نمو الجريب في المختبر على عدد قليل من التقارير مع مراحل جريب متغيرة في بداية الاستزراع ، بالإضافة إلى طول متغير للثقافة بين البروتوكولات^17،19.

استخدمت الطرق الموضحة في الأدبيات لحصاد بصيلات ما قبل البقر من المبيض البقري في الغالب تقنيات ميكانيكية وإنزيمية ، إما معزولة أو مجتمعة²،¹⁴،^17،20. استخدم التقرير الأول لبروتوكول عزل الجريب البقري خالط الأنسجة والترشيح التسلسلي لمعالجة المبايض الكاملة²⁰. تبعت هذه الدراسة تقارير تجمع بين الإجراءات الميكانيكية والأنزيمية التي استخدمت كولاجيناز¹⁴. الموضوع المتكرر عند استخدام كولاجيناز لهضم أنسجة المبيض هو الخطر المحتمل لتلف الغشاء القاعدي المسامي ، مما قد يضر بصلاحية الجريب¹⁴،²¹،^22،23. لذلك ، تم استخدام مجموعات مختلفة من الطرق الميكانيكية ، مثل استخدام مفرمة الأنسجة والماصات المتكررة أو مفرمة الأنسجة جنبا إلى جنب مع التجانس²⁰،²⁴،^25،26. هناك تقنية ميكانيكية أخرى تم وصفها تستخدم الإبر لتشريح بصيلات ما قبل الجريبات مباشرة من أنسجة المبيض ، وهي مفيدة بشكل خاص لعزل بصيلات ثانوية أكبر (>200 ميكرومتر). ومع ذلك ، فإن هذه العملية تستغرق وقتا طويلا ، وغير فعالة لعزل بصيلات ما قبل البكرات الأصغر ، وتعتمد على مجموعة المهارات عند تجربتها في المبايض البقري¹⁹،^27،28.

بالاستفادة من التقنيات المختلفة الموضحة في الأدبيات ، يهدف هذا البروتوكول إلى تحسين عزل بصيلات ما قبل البقران من المبايض المفردة بطريقة بسيطة ومتسقة وفعالة تتجنب الحضانة في المحاليل الأنزيمية. سيوفر تحسين طرق عزل الجريبات قبل الجريبية فرصة لتعزيز فهم هذه المرحلة من تكوين الجريب وتمكين تطوير أنظمة استزراع فعالة لتطوير بصيلات ما قبل الجريبات إلى المرحلة الغارية. ستكون الإجراءات التفصيلية الموضحة هنا لعزل البصيلات قبل الجريبة من الثدييات الكبيرة مثل الأنواع البقرية حيوية للباحثين الذين يهدفون إلى دراسة تكوين الجريبات المبكر في الأنواع غير الفئران التي يمكن ترجمتها إلى البشر.

Protocol

تم الحصول على المبايض البقري (Bos taurus) من مسلخ محلي ونقلها إلى المختبر في غضون 6 ساعات من التجميع. نظرا للعدد الكبير من الحيوانات التي تتم معالجتها في المنشأة ، فإن عمر وسلالة ومرحلة دورة شبق الحيوانات غير معروفة. نظرا لعدم استخدام أي حية في هذه التجارب ، لم يكن هناك حاجة إلى بروتوكول معت?…

Representative Results

نظرة عامة وخطوات حاسمةباستخدام هذا البروتوكول ، يمكن عزل بصيلات الأبقار الصغيرة بشكل موثوق من المبايض المفردة بأعداد ذات صلة تجريبيا. من إجمالي 30 مكررا ، تم الحصول على 41 جريبة في المتوسط لكل مكرر ، مع نطاق من 11 إلى 135 بصيلة (الشكل 4 أ). في 14 نسخة مكررة ، تم تمييز الب…

Discussion

يفصل البروتوكول الحالي طريقة قابلة للتكرار لاسترداد الجريبات قبل الحمراء في المرحلة المبكرة ، وتحديدا في المراحل الأولية والثانوية المبكرة ، من المبيض البقري. يعتمد هذا البروتوكول على التقارير السابقة²⁰،²⁵،^{30،34،35،</…}

Materials

5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette	Duran Wheaton Kimble	63A54	Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining
20 mL Luer-lock Syringe	Fisher Scientific	Z116882-100EA	Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
#21 Sterile Scalpel Blade	Fisher Scientific	50-365-023	Used to cut the ovaries and remove the medula
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-547	Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer
104 mm Plastic Funnel	Fisher Scientific	10-348C	Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over
300 μm Cell Strainer	pluriSelect	43-50300-03	Used to filter the filtrate from the cheese cloth
500 mL Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	FB500500	Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth
Air-Tite Sterile Needles 18 G	Thermo Fisher Scientific	14-817-151	18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm	Fisher Scientific	14-817-171	Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck
BD Hoechst 33342 Solution	Fisher Scientific	BDB561908	Fluorescent DNA stain
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G	Component of follicle wash media
Cheese Cloth	Electron Microscopy Sciences	71748-00	First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris
Classic Double Edge Safety Razor Blades	Wilkinson Sword	N/A	Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunostaining
Eisco Latex Pipette Bulbs	Fisher Scientific	S29388	Rubber bulb to use with Pasteur pipettes
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H3375	Component of follicle wash media
Homogenizer	VWR	10032-336	Homogenize the ovarian tissue to release follicles
ImageJ/Fiji	NIH	v2.3.1	Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10184	Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization
Microscope – Stereoscope	Olympus	SZX2-ILLT	Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate
Microscope – Inverted	Nikon	Diaphot 300	Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles
Microscope – Inverted	ECHO	Revolve R4	Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410-1L	Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching
Non-essential Amino Acids (NEAA)	Gibco	11140-050	Component of follicle wash medium
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-001	Reagent for immunostaining blocking buffer
Nunc 4-well Dishes for IVF	Thermo Fisher Scientific	144444	4-well dishes for follicle isolation and washing
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Gibco	15-140-122	Component of follicle wash medium
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm	Ted Pella	10184-04	Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP665-1	Washing buffer for ovaries and follicles
Plastic Cutting Board	Fisher Scientific	09-002-24A	Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries
Polyvinylpyrrolidone (PVP)	Fisher Scientific	BP431-100	Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue
Qiagen RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA column clean-up kit
R	The R Foundation	v4.1.2	Statistical analysis software
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody	Abcam	ab181701	Cx37 primary antibody for immunostaining
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	K1691	cDNA synthesis kit
Rstudio	RStudio, PBC	v2021.09.2	Statistical analysis software
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified)	Fisher Scientific	SS266-1	Used to increase media pH to 7.6-7.8
Sodium Pyruvate (NaPyr)	Gibco	11360-070	Component of follicle wash medium
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm	Thermo Fisher Scientific	60872-310	Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725271	Mastermix for PCR reaction
Steritop Threaded Bottle Top Filter	Sigma-Aldrich	S2GPT02RE	Used to sterilize follicle wash medium
SYBR-safe DNA gel stain	Thermo Fisher Scientific	S33102	Staining to visual PCR products on agarose gel
TCM199 with Hank’s Salts	Gibco	12-350-039	Component of follicle wash medium
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergent for immunostaining permeabilization buffer
Trizol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	RNA isolation reagent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15-250-061	Used for testing viability of isolated follicles
Tween 20			Detergent for immunostaining wash buffer
Warmer Plate Universal	WTA	20931	Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope
Wiretrol II Calibrated Micropipets	Drummond	50002-005	Glass micropipettes to manipulate follicles