Isolering af små præantrale follikler fra kvægets æggestok ved hjælp af en kombination af fragmentering, homogenisering og seriel filtrering
Summary
Fremme af undersøgelsen af præantral folliculogenese kræver effektive metoder til follikelisolering fra enkelt æggestokke. Præsenteret her er en strømlinet, mekanisk protokol til follikelisolering fra kvæg æggestokke ved hjælp af en vævshakker og homogenisator. Denne metode tillader indsamling af et stort antal levedygtige præantrale follikler fra en enkelt æggestok.
Abstract
Forståelse af den fulde proces med pattedyrs folliculogenese er afgørende for at forbedre assisterede reproduktionsteknologier hos husdyr, mennesker og truede arter. Forskningen har for det meste været begrænset til antrale og store præantrale follikler på grund af vanskeligheder med isolering af mindre præantrale follikler, især hos store pattedyr såsom kvæg. Dette arbejde præsenterer en effektiv tilgang til at hente et stort antal små præantrale follikler fra en enkelt kvæg æggestok. Cortex af individuelle kvæg æggestokke blev skåret i 500 μm terninger ved hjælp af en vævskhopper og homogeniseret i 6 minutter ved 9.000-11.000 o / min ved hjælp af en 10 mm sonde. Stort affald blev adskilt fra homogenatet ved hjælp af en osteklud efterfulgt af seriel filtrering gennem 300 μm og 40 μm cellesi. Indholdet i 40 μm silen blev skyllet i en søgeskål, hvor follikler blev identificeret og opsamlet i en dråbe medium. Levedygtigheden af de indsamlede follikler blev testet via trypanblå farvning. Denne metode muliggør isolering af et stort antal levedygtige små præantrale follikler fra en enkelt kvæg æggestok på ca. 90 min. Det er vigtigt, at denne metode er helt mekanisk og undgår brugen af enzymer til at adskille vævet, hvilket kan beskadige folliklerne. Folliklerne opnået ved anvendelse af denne protokol kan anvendes til downstream-applikationer såsom isolering af RNA til RT-qPCR, immunolokalisering af specifikke proteiner og in vitro-kultur .
Introduction
Ovariefollikler er de funktionelle enheder i æggestokken, der er ansvarlige for produktionen af gamete (oocyt) samt hormoner, der er kritiske for reproduktiv funktion og generel sundhed. Primordiale follikler dannes i æggestokken under fosterudvikling eller i neonatalperioden afhængigt af arten1, og de udgør en kvindes ovariereservat. Follikulær vækst begynder med aktivering af primordiale follikler, der forlader hvilebassinet og går ind i vækstfasen. Præantral folliculogenese, der omfatter alle follikelstadier før antrumudvikling, er en meget dynamisk proces, der kræver synkrone morfologiske og metaboliske ændringer i oocytten og de omgivende granulosaceller, drevet af tæt kommunikation mellem disse to celletyper 2,3. Præantrale follikler udgør størstedelen af de follikulære enheder, der findes i æggestokken på et givet tidspunkt4. Udvikling gennem de præantrale stadier af folliculogenese anslås at være flere uger længere end antral udvikling5,6, og denne tid er nødvendig for, at oocyt- og somatiske celler får tilstrækkelig modenhed til at komme ind i det sidste udviklingsstadium (dvs. antralstadiet) og forberede sig på ægløsning, befrugtning og embryonal udvikling 7,8,9.
Meget af den nuværende viden om ovarie præantral folliculogenese kommer fra musemodeller10,11,12,13, delvis på grund af letheden ved at genvinde et stort antal af disse follikler fra en mindre og mindre fibrøs æggestok. Selvom rapporter om isolering af et stort antal præantrale follikler fra kvæg æggestokke går ca. 30 år14 tilbage, er en mere fuldstændig forståelse af de processer, der regulerer udviklingen af disse tidlige follikler, forblevet urealiseret, hovedsageligt på grund af manglen på optimerede, effektive og gentagelige metoder til at hente et tilstrækkeligt antal levedygtige præantrale follikler, især i tidlige udviklingsstadier. Med den stigende interesse for at bevare ovariereservatet til fremtidig brug i assisteret reproduktion hos mennesker bliver køer en attraktiv model på grund af deres mere lignende ovariestruktur15. Imidlertid er kvægets æggestok markant rigere på kollagen sammenlignet med musens æggestok16, hvilket gør mekanisk isolering ved hjælp af metoder beskrevet for musen meget ineffektiv. Bestræbelser på at udvide fertilitetsbevarelsesteknikker omfatter fuldstændig in vitro-vækst af præantrale follikler til antralstadiet efterfulgt af in vitro-modning (IVM) af de lukkede oocytter, in vitro-befrugtning (IVF) og embryoproduktion og -overførsel 17. Indtil videre er hele denne proces kun opnået hos mus18. Hos kvæg er fremskridtene mod follikelvækst in vitro begrænset til nogle få rapporter med variable follikelstadier i starten af kulturen samt variabel kulturlængde mellem protokollerne17,19.
De metoder, der er beskrevet i litteraturen til høst af præantrale follikler fra kvægets æggestok, har hovedsagelig anvendt mekaniske og enzymatiske teknikker, enten isoleret eller i kombination 2,14,17,20. Den første rapport om en protokol for præantral follikelisolering fra kvæg anvendte en vævshomogenisator og seriel filtrering til behandling af hele æggestokke20. Denne undersøgelse blev efterfulgt af rapporter, der kombinerede mekaniske og enzymatiske procedurer, der anvendte collagenase14. Et tilbagevendende tema ved anvendelse af collagenase til at fordøje æggestokkene er den potentielle risiko for beskadigelse af follikulær kældermembran, hvilket kan kompromittere follikellevedygtigheden 14,21,22,23. Derfor er der anvendt forskellige kombinationer af mekaniske metoder, såsom brugen af en vævshakker og gentagen pipettering eller en vævshakker kombineret med homogenisering20,24,25,26. En anden mekanisk teknik, der er beskrevet, bruger nåle til at dissekere præantrale follikler direkte fra æggestokkene, hvilket er særligt nyttigt til isolering af større (>200 μm) sekundære follikler. Denne proces er imidlertid tidskrævende, ineffektiv til isolering af mindre præantrale follikler og er færdighedsafhængig, når den forsøges i kvæg æggestokke 19,27,28.
Ved at udnytte de forskellige teknikker, der er beskrevet i litteraturen, havde denne protokol til formål at optimere isoleringen af præantrale follikler fra enkeltkvæg æggestokke på en enkel, konsistent og effektiv måde, der undgår inkubation i enzymatiske opløsninger. Forbedring af metoderne til isolering af præantrale follikler vil give mulighed for at forbedre forståelsen af dette stadium af folliculogenese og muliggøre udvikling af effektive kultursystemer til udvikling af præantrale follikler til antralstadiet. De detaljerede procedurer, der er beskrevet heri for isolering af præantrale follikler fra et stort pattedyr som kvægarten, vil være afgørende for forskere, der sigter mod at studere tidlig folliculogenese i en ikke-murinart, der kan oversættes til mennesker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol beskriver en reproducerbar metode til at hente præantrale follikler i det tidlige stadium, specifikt i primære og tidlige sekundære stadier, fra kvægets æggestok. Denne protokol bygger på tidligere rapporter 20,25,30,34,35,36 og giver optimeringer, der resulterer i isolering af et meningsfuldt antal follikl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev delvist finansieret af USDA Multi-state projekt W4112 og UC Davis Jastro Shields pris til SM.
Forfatterne vil gerne udvide deres påskønnelse til Central Valley Meat, Inc. for at levere kvæg æggestokke, der anvendes i alle eksperimenter. Forfatterne takker også Olivia Silvera for hjælp med behandling af æggestokke og follikelisolering.
Materials
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
Riferimenti
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
- Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
- Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
- Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Biologia dello sviluppo. 279 (1), 20-30 (2005).
- Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
- Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
- Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
- McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
- Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
- Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
- Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
- Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
- Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
- Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
- Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
- Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
- Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
- Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
- Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
- Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
- vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
- Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
- Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
- Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
- Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
- Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
- Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
- Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
- Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
- Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
- Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
- Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the ‘holy grail’ for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
