Isolement de petits follicules préantraux de l’ovaire bovin à l’aide d’une combinaison de fragmentation, d’homogénéisation et de filtration en série
Summary
Faire progresser l’étude de la folliculogenèse préantrale nécessite des méthodes efficaces d’isolement des follicules à partir d’ovaires simples. Un protocole mécanique simplifié pour l’isolement des follicules des ovaires bovins à l’aide d’un hachoir et d’un homogénéisateur de tissus est présenté ici. Cette méthode permet de prélever un grand nombre de follicules préantraux viables à partir d’un seul ovaire.
Abstract
Comprendre le processus complet de la folliculogenèse des mammifères est crucial pour améliorer les technologies de procréation assistée chez le bétail, les humains et les espèces en voie de disparition. La recherche s’est principalement limitée aux follicules antraux et aux grands follicules préantraux en raison de la difficulté d’isoler les follicules préantraux plus petits, en particulier chez les grands mammifères tels que les espèces bovines. Ce travail présente une approche efficace pour récupérer un grand nombre de petits follicules préantraux d’un seul ovaire bovin. Le cortex des ovaires bovins individuels a été tranché en cubes de 500 μm à l’aide d’un hachoir à tissus et homogénéisé pendant 6 minutes à 9 000-11 000 tr/min à l’aide d’une sonde de 10 mm. Les gros débris ont été séparés de l’homogénat à l’aide d’un tissu à fromage, suivi d’une filtration en série à travers des crépines cellulaires de 300 μm et 40 μm. Le contenu retenu dans la passoire de 40 μm a été rincé dans un plat de recherche, où les follicules ont été identifiés et recueillis dans une goutte de milieu. La viabilité des follicules collectés a été testée par coloration bleue de trypan. Cette méthode permet d’isoler un grand nombre de petits follicules préantraux viables d’un seul ovaire bovin en 90 minutes environ. Fait important, cette méthode est entièrement mécanique et évite l’utilisation d’enzymes pour dissocier le tissu, ce qui peut endommager les follicules. Les follicules obtenus à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés pour des applications en aval telles que l’isolement de l’ARN pour la RT-qPCR, l’immunolocalisation de protéines spécifiques et la culture in vitro .
Introduction
Les follicules ovariens sont les unités fonctionnelles de l’ovaire, responsables de la production du gamète (ovocyte) ainsi que des hormones essentielles à la fonction de reproduction et à la santé globale. Les follicules primordiaux se forment dans l’ovaire au cours du développement fœtal ou dans la période néonatale selon les espèces1, et ils constituent la réserve ovarienne d’une femelle. La croissance folliculaire commence par l’activation des follicules primordiaux qui quittent la piscine de repos et entrent dans la phase de croissance. La folliculogenèse préantrale, englobant tous les stades folliculaires avant le développement de l’antre, est un processus hautement dynamique qui nécessite des changements morphologiques et métaboliques synchrones dans l’ovocyte et les cellules granulosa environnantes, entraînés par une communication étroite entre ces deux types de cellules 2,3. Les follicules préantraux constituent la majorité des unités folliculaires présentes dans l’ovaire à un moment donné4. On estime que le développement par les stades préantraux de la folliculogenèse est de plusieurs semaines plus long que le développement antral 5,6, et ce temps est nécessaire pour que les cellules ovocytaires et somatiques acquièrent une maturité suffisante pour entrer dans la phase finale de développement (c’est-à-dire le stade antral) et se préparer à l’ovulation, à la fécondation et au développement embryonnaire 7,8,9.
Une grande partie des connaissances actuelles sur la follicululogenèse préantrale ovarienne provient des modèles murins10,11,12,13, en partie en raison de la facilité de récupération d’un grand nombre de ces follicules à partir d’un ovaire plus petit et moins fibreux. Bien que les rapports d’isolement d’un grand nombre de follicules préantraux à partir d’ovaires bovins remontent à environ 30 ans14, une compréhension plus complète des processus régulant le développement de ces follicules à un stade précoce n’a pas été réalisée, en grande partie en raison du manque de méthodes optimisées, efficaces et reproductibles pour récupérer un nombre suffisant de follicules préantraux viables, en particulier aux premiers stades de développement. Avec l’intérêt croissant pour la préservation de la réserve ovarienne pour une utilisation future dans la procréation assistée chez l’homme, les vaches deviennent un modèle attrayant en raison de leur structure ovarienne plus similaire15. Cependant, l’ovaire bovin est nettement plus riche en collagène que l’ovaire de souris16, ce qui rend l’isolement mécanique à l’aide de méthodes décrites pour la souris très inefficace. Les efforts visant à étendre les techniques de préservation de la fertilité comprennent la croissance in vitro complète des follicules préantraux jusqu’au stade antral, suivie de la maturation in vitro (MIV) des ovocytes fermés, de la fécondation in vitro (FIV) et de la production et du transfert d’embryons17. Jusqu’à présent, tout ce processus n’a été réalisé que chez la souris18. Chez les bovins, les progrès vers la croissance des follicules in vitro se limitent à quelques rapports avec des stades folliculaires variables au début de la culture, ainsi qu’une durée variable de culture entre les protocoles17,19.
Les méthodes décrites dans la littérature pour la récolte des follicules préantraux de l’ovaire bovin ont principalement utilisé des techniques mécaniques et enzymatiques, isolées ou en combinaison 2,14,17,20. Le premier rapport d’un protocole d’isolement du follicule préantral bovin utilisait un homogénéisateur tissulaire et une filtration en série pour traiter les ovaires entiers20. Cette étude a été suivie de rapports combinant des procédures mécaniques et enzymatiques utilisant la collagénase14. Un thème récurrent lors de l’utilisation de la collagénase pour digérer le tissu ovarien est le risque potentiel de dommages à la membrane basale folliculaire, ce qui peut compromettre la viabilité du follicule 14,21,22,23. Par conséquent, différentes combinaisons de méthodes mécaniques ont été employées, telles que l’utilisation d’un hachoir à tissus et de pipetage répété ou d’un hachoir à tissus combiné à l’homogénéisation20,24,25,26. Une autre technique mécanique qui a été décrite utilise des aiguilles pour disséquer les follicules préantraux directement à partir du tissu ovarien, ce qui est particulièrement utile pour isoler des follicules secondaires plus grands (>200 μm). Cependant, ce processus prend du temps, est inefficace pour isoler les petits follicules préantraux et dépend des compétences lorsqu’il est tenté dans les ovaires bovins 19,27,28.
Tirant parti des différentes techniques décrites dans la littérature, ce protocole visait à optimiser l’isolement des follicules préantraux à partir d’ovaires monobovins d’une manière simple, cohérente et efficace qui évite l’incubation dans des solutions enzymatiques. L’amélioration des méthodes d’isolement des follicules préantraux permettra de mieux comprendre cette étape de la folliculogenèse et de permettre le développement de systèmes de culture efficaces pour développer les follicules préantraux jusqu’au stade antral. Les procédures détaillées décrites ici pour l’isolement des follicules préantraux d’un grand mammifère tel que l’espèce bovine seront vitales pour les chercheurs qui souhaitent étudier la folliculogenèse précoce chez une espèce non murine qui est transposable à l’homme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent protocole détaille une méthode reproductible pour récupérer les follicules préantraux à un stade précoce, en particulier aux stades primaire et secondaire précoce, de l’ovaire bovin. Ce protocole s’appuie sur les rapports précédents 20,25,30,34,35,36 et fournit des optimisations qui permettent d’isoler un nombre significatif de follicules d’un ovaire individuel.<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été partiellement financé par le projet multi-états W4112 de l’USDA et le prix UC Davis Jastro Shields à SM.
Les auteurs aimeraient remercier Central Valley Meat, Inc. d’avoir fourni les ovaires bovins utilisés dans toutes les expériences. Les auteurs remercient également Olivia Silvera pour son aide au traitement des ovaires et à l’isolement des follicules.
Materials
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
Riferimenti
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