Isolierung kleiner präantraler Follikel aus dem Rindereierstock durch eine Kombination aus Fragmentierung, Homogenisierung und serieller Filtration

Summary

Um die Untersuchung der präantralen Follikulogenese voranzutreiben, sind effiziente Methoden der Follikelisolierung aus einzelnen Eierstöcken erforderlich. Hier wird ein optimiertes, mechanisches Protokoll zur Follikelisolierung aus Rinderovarien mit einem Gewebezerkleinerer und Homogenisator vorgestellt. Diese Methode ermöglicht die Entnahme einer großen Anzahl lebensfähiger präantraler Follikel aus einem einzigen Eierstock.

Abstract

Das Verständnis des gesamten Prozesses der Follikulogenese von Säugetieren ist entscheidend für die Verbesserung der assistierten Reproduktionstechnologien bei Nutztieren, Menschen und gefährdeten Arten. Die Forschung beschränkte sich meist auf antrale und große präantrale Follikel aufgrund von Schwierigkeiten bei der Isolierung kleinerer präantraler Follikel, insbesondere bei großen Säugetieren wie Rindern. Diese Arbeit stellt einen effizienten Ansatz dar, um eine große Anzahl kleiner präantraler Follikel aus einem einzelnen Rinderstock zu gewinnen. Der Kortex einzelner Rinderovarien wurde mit einem Gewebechopper in 500 μm Würfel geschnitten und 6 min bei 9.000-11.000 U/min mit einer 10 mm Sonde homogenisiert. Große Ablagerungen wurden mit einem Käsetuch vom Homogenat getrennt, gefolgt von einer seriellen Filtration durch 300 μm und 40 μm Zellsieb. Der im 40-μm-Sieb zurückgehaltene Inhalt wurde in eine Suchschale gespült, wo Follikel identifiziert und zu einem Tropfen Medium gesammelt wurden. Die Lebensfähigkeit der gesammelten Follikel wurde mittels Trypanblau-Färbung getestet. Diese Methode ermöglicht die Isolierung einer großen Anzahl lebensfähiger kleiner präantraler Follikel aus einem einzigen Rindereierstock in ca. 90 min. Wichtig ist, dass diese Methode vollständig mechanisch ist und die Verwendung von Enzymen zur Dissoziation des Gewebes vermeidet, was die Follikel schädigen kann. Die mit diesem Protokoll erhaltenen Follikel können für nachgeschaltete Anwendungen wie die Isolierung von RNA für RT-qPCR, Immunlokalisierung spezifischer Proteine und In-vitro-Kultur verwendet werden.

Introduction

Eierstockfollikel sind die funktionellen Einheiten des Eierstocks, die für die Produktion der Gameten (Eizellen) sowie von Hormonen verantwortlich sind, die für die Fortpflanzungsfunktion und die allgemeine Gesundheit entscheidend sind. Primordiale Follikel bilden sich im Eierstock während der fetalen Entwicklung oder in der Neugeborenenperiode, abhängig von der Art¹, und sie bilden die ovarielle Reserve einer Frau. Das follikuläre Wachstum beginnt mit der Aktivierung von primordialen Follikeln, die das Ruhebecken verlassen und in die Wachstumsphase eintreten. Die präantrale Follikulogenese, die alle Follikelstadien vor der Entwicklung des Antrums umfasst, ist ein hochdynamischer Prozess, der synchrone morphologische und metabolische Veränderungen in der Eizelle und den umgebenden Granulosazellen erfordert, die durch eine enge Kommunikation zwischen diesen beiden Zelltypen angetrieben^{werden 2,3}. Präantralfollikel bilden die Mehrheit der follikulären Einheiten, die zu einem bestimmten Zeitpunkt im Eierstock gefunden werden⁴. Es wird geschätzt, dass die Entwicklung durch die präantralen Stadien der Follikulogenese mehrere Wochen länger dauert als die antrale Entwicklung ^5,6, und diese Zeit ist notwendig, damit die Eizellen und die Körperzellen eine ausreichende Reife erlangen, um in das Endstadium der Entwicklung (d.h. das Antralstadium) einzutreten und sich auf Eisprung, Befruchtung und Embryonalentwicklung vorzubereiten ^7,8,9.

Ein Großteil des aktuellen Wissens über die präantrale Follikulogenese der Eierstöcke stammt aus Mausmodellen^10,11,12,13, was zum Teil auf die Leichtigkeit zurückzuführen ist^, eine große Anzahl dieser Follikel aus einem kleineren und weniger faserigen Eierstock zu gewinnen. Obwohl Berichte über die Isolierung einer großen Anzahl präantraler Follikel aus Rinderovarien etwa 30 Jahre zurückreichen¹⁴, ist ein vollständigeres Verständnis der Prozesse, die die Entwicklung dieser Follikel im Frühstadium regulieren, unrealisiert geblieben, hauptsächlich aufgrund des Mangels an optimierten, effizienten und wiederholbaren Methoden, um eine ausreichende Anzahl lebensfähiger präantraler Follikel zu gewinnen, insbesondere in frühen Entwicklungsstadien. Mit dem zunehmenden Interesse, die Eierstockreserve für die zukünftige Verwendung in der assistierten Reproduktion beim Menschen zu erhalten, werden Kühe aufgrund ihrer ähnlicheren Eierstockstruktur zu einem attraktiven Modell¹⁵. Der Rinderstock ist jedoch deutlich kollagenreicher als der Eierstock der Maus¹⁶, was die mechanische Isolierung mit den für die Maus beschriebenen Methoden sehr ineffizient macht. Die Bemühungen zur Erweiterung der Techniken zur Erhaltung der Fruchtbarkeit umfassen das vollständige In-vitro-Wachstum der präantralen Follikel in das Antralstadium, gefolgt von der In-vitro-Reifung (IVM) der eingeschlossenen Eizellen, der In-vitro-Fertilisation (IVF) sowie der Embryonenproduktion und –übertragung¹⁷. Bisher wurde dieser gesamte Prozess nur bei Mäusen¹⁸ erreicht. Bei Rindern beschränkt sich der Fortschritt in Richtung Follikelwachstum in vitro auf wenige Berichte mit variablen Follikelstadien zu Beginn der Kultur sowie variabler Kulturlänge zwischen den Protokollen^17,19.

Die in der Literatur beschriebenen Methoden zur Gewinnung präantraler Follikel aus dem Rindereierstock haben meist mechanische und enzymatische Techniken verwendet, entweder isoliert oder in Kombination 2,14,17,20. Der erste Bericht über ein Protokoll zur präantralen Follikelisolierung von Rindern verwendete einen Gewebehomogenisator und eine serielle Filtration, um ganze Eierstöcke zu verarbeiten²⁰. Dieser Studie folgten Berichte, die mechanische und enzymatische Verfahren kombinierten, die Kollagenase¹⁴ verwendeten. Ein wiederkehrendes Thema bei der Verwendung von Kollagenase zur Verdauung des Eierstockgewebes ist das potenzielle Risiko einer Schädigung der follikulären Basalmembran, die die Lebensfähigkeit der Follikel beeinträchtigen kann 14,21,22,23. Daher wurden verschiedene Kombinationen von mechanischen Methoden verwendet, wie die Verwendung eines Gewebehackers und wiederholtes Pipettieren oder eines Gewebehackers in Kombination mit Homogenisierung^20,24,25,26. Eine andere mechanische Technik, die beschrieben wurde, verwendet Nadeln, um präantrale Follikel direkt aus dem Eierstockgewebe zu sezieren, was besonders nützlich ist, um größere (>200 μm) sekundäre Follikel zu isolieren. Dieser Prozess ist jedoch zeitaufwendig, ineffizient für die Isolierung kleinerer präantraler Follikel und abhängig von Fähigkeiten, wenn er in Rinderovarien versucht^wird 19,27,28.

Unter Ausnutzung der verschiedenen in der Literatur beschriebenen Techniken zielte dieses Protokoll darauf ab, die Isolierung präantraler Follikel aus einzelnen Rinderovarien auf einfache, konsistente und effiziente Weise zu optimieren, die eine Inkubation in enzymatischen Lösungen vermeidet. Die Verbesserung der Methoden zur Isolierung präantraler Follikel bietet die Möglichkeit, das Verständnis dieses Stadiums der Follikulogenese zu verbessern und die Entwicklung effektiver Kultursysteme zur Entwicklung präantraler Follikel bis zum Antralstadium zu ermöglichen. Die hier beschriebenen detaillierten Verfahren zur Isolierung präantraler Follikel von einem großen Säugetier wie der Rinderart werden für Forscher, die die frühe Follikulogenese bei einer nicht-murinen Art untersuchen wollen, die auf den Menschen übertragbar ist, von entscheidender Bedeutung sein.

Protocol

Die Eierstöcke von Rindern (Bos taurus) wurden aus einem örtlichen Schlachthof bezogen und innerhalb von 6 Stunden nach der Entnahme ins Labor transportiert. Aufgrund der großen Anzahl von Tieren, die in der Einrichtung verarbeitet werden, sind Alter, Rasse und Stadium des Brunstzyklus der Tiere unbekannt. Da in diesen Versuchen keine lebenden Tiere verwendet wurden, war kein genehmigtes Tierpflege- und Anwendungsprotokoll erforderlich. 1. Vorbereitung von Geräten und Reagen…

Representative Results

Überblick und kritische SchritteMit diesem Protokoll können kleine präantrale Rinderfollikel zuverlässig aus einzelnen Eierstöcken in experimentell relevanter Anzahl isoliert werden. Von insgesamt 30 Replikaten wurden durchschnittlich 41 Follikel pro Replikat mit einem Bereich von 11 bis 135 Follikeln erhalten (Abbildung 4A). In 14 Replikaten wurden die Follikel für das Entwicklungsstadium wie zuvor beschrieben26 durch Messung des Follikeldu…

Discussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Gewinnung präantraler Follikel im Frühstadium, insbesondere in primären und frühen sekundären Stadien, aus dem Rindereierstock. Dieses Protokoll baut auf früheren Berichten 20,25,30,34,35,36 auf und bietet Optimierungen^, die zur Isolierung einer sinnvollen Anza…

Materials

5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette	Duran Wheaton Kimble	63A54	Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining
20 mL Luer-lock Syringe	Fisher Scientific	Z116882-100EA	Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
#21 Sterile Scalpel Blade	Fisher Scientific	50-365-023	Used to cut the ovaries and remove the medula
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-547	Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer
104 mm Plastic Funnel	Fisher Scientific	10-348C	Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over
300 μm Cell Strainer	pluriSelect	43-50300-03	Used to filter the filtrate from the cheese cloth
500 mL Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	FB500500	Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth
Air-Tite Sterile Needles 18 G	Thermo Fisher Scientific	14-817-151	18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm	Fisher Scientific	14-817-171	Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck
BD Hoechst 33342 Solution	Fisher Scientific	BDB561908	Fluorescent DNA stain
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G	Component of follicle wash media
Cheese Cloth	Electron Microscopy Sciences	71748-00	First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris
Classic Double Edge Safety Razor Blades	Wilkinson Sword	N/A	Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunostaining
Eisco Latex Pipette Bulbs	Fisher Scientific	S29388	Rubber bulb to use with Pasteur pipettes
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H3375	Component of follicle wash media
Homogenizer	VWR	10032-336	Homogenize the ovarian tissue to release follicles
ImageJ/Fiji	NIH	v2.3.1	Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10184	Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization
Microscope – Stereoscope	Olympus	SZX2-ILLT	Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate
Microscope – Inverted	Nikon	Diaphot 300	Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles
Microscope – Inverted	ECHO	Revolve R4	Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410-1L	Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching
Non-essential Amino Acids (NEAA)	Gibco	11140-050	Component of follicle wash medium
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-001	Reagent for immunostaining blocking buffer
Nunc 4-well Dishes for IVF	Thermo Fisher Scientific	144444	4-well dishes for follicle isolation and washing
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Gibco	15-140-122	Component of follicle wash medium
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm	Ted Pella	10184-04	Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP665-1	Washing buffer for ovaries and follicles
Plastic Cutting Board	Fisher Scientific	09-002-24A	Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries
Polyvinylpyrrolidone (PVP)	Fisher Scientific	BP431-100	Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue
Qiagen RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA column clean-up kit
R	The R Foundation	v4.1.2	Statistical analysis software
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody	Abcam	ab181701	Cx37 primary antibody for immunostaining
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	K1691	cDNA synthesis kit
Rstudio	RStudio, PBC	v2021.09.2	Statistical analysis software
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified)	Fisher Scientific	SS266-1	Used to increase media pH to 7.6-7.8
Sodium Pyruvate (NaPyr)	Gibco	11360-070	Component of follicle wash medium
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm	Thermo Fisher Scientific	60872-310	Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725271	Mastermix for PCR reaction
Steritop Threaded Bottle Top Filter	Sigma-Aldrich	S2GPT02RE	Used to sterilize follicle wash medium
SYBR-safe DNA gel stain	Thermo Fisher Scientific	S33102	Staining to visual PCR products on agarose gel
TCM199 with Hank’s Salts	Gibco	12-350-039	Component of follicle wash medium
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergent for immunostaining permeabilization buffer
Trizol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	RNA isolation reagent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15-250-061	Used for testing viability of isolated follicles
Tween 20			Detergent for immunostaining wash buffer
Warmer Plate Universal	WTA	20931	Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope
Wiretrol II Calibrated Micropipets	Drummond	50002-005	Glass micropipettes to manipulate follicles