प्रीएंट्राल फॉलिकुलोजेनेसिस के अध्ययन को आगे बढ़ाने के लिए एकल अंडाशय से कूप अलगाव के कुशल तरीकों की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तुत एक ऊतक चॉपर और होमोजेनाइज़र का उपयोग करके गोजातीय अंडाशय से कूप अलगाव के लिए एक सुव्यवस्थित, यांत्रिक प्रोटोकॉल है। यह विधि एक अंडाशय से बड़ी संख्या में व्यवहार्य प्रीएंट्राल रोम के संग्रह की अनुमति देती है।
स्तनधारी फॉलिकुलोजेनेसिस की पूरी प्रक्रिया को समझना पशुधन, मनुष्यों और लुप्तप्राय प्रजातियों में सहायक प्रजनन प्रौद्योगिकियों में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है। अनुसंधान ज्यादातर छोटे प्रीएंट्राल रोम के अलगाव में कठिनाई के कारण एंट्रल और बड़े प्रीएंट्राल रोम तक सीमित रहा है, खासकर बड़े स्तनधारियों जैसे गोजातीय प्रजातियों में। यह काम एक गोजातीय अंडाशय से बड़ी संख्या में छोटे प्रीएंट्राल रोम को पुनः प्राप्त करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। अलग-अलग गोजातीय अंडाशय के कॉर्टेक्स को एक ऊतक चॉपर का उपयोग करके 500 μm क्यूब्स में काटा गया और 10 मिमी जांच का उपयोग करके 9,000-11,000 आरपीएम पर 6 मिनट के लिए समरूप किया गया। बड़े मलबे को पनीर कपड़े का उपयोग करके होमोजेनेट से अलग किया गया था, इसके बाद 300 μm और 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से सीरियल निस्पंदन किया गया था। 40 μm छन्नी में रखी गई सामग्री को एक खोज पकवान में धोया गया था, जहां रोम की पहचान की गई थी और माध्यम की एक बूंद में एकत्र किया गया था। एकत्र किए गए रोम की व्यवहार्यता का परीक्षण ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग के माध्यम से किया गया था। यह विधि लगभग 90 मिनट में एक गोजातीय अंडाशय से बड़ी संख्या में व्यवहार्य छोटे प्रीएंट्राल रोम के अलगाव को सक्षम बनाती है। महत्वपूर्ण रूप से, यह विधि पूरी तरह से यांत्रिक है और ऊतक को अलग करने के लिए एंजाइमों के उपयोग से बचती है, जो रोम को नुकसान पहुंचा सकती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त रोम का उपयोग डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है जैसे कि आरटी-क्यूपीसीआर के लिए आरएनए का अलगाव, विशिष्ट प्रोटीन का इम्यूनोलोकलाइजेशन और इन विट्रो कल्चर।
डिम्बग्रंथि के रोम अंडाशय की कार्यात्मक इकाइयाँ हैं, जो युग्मक (अंडाणु) के उत्पादन के साथ-साथ प्रजनन समारोह और समग्र स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण हार्मोन के उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं। भ्रूण के विकास के दौरान या प्रजातियों1 के आधार पर नवजात अवधि में अंडाशय में आदिम रोम बनते हैं, और वे एक महिला के डिम्बग्रंथि रिजर्व का गठन करते हैं। कूपिक विकास आदिम रोम के सक्रियण के साथ शुरू होता है जो आराम करने वाले पूल को छोड़ देता है और बढ़ते चरण में प्रवेश करता है। प्रीएंट्राल फॉलिकुलोजेनेसिस, जिसमें एंट्रम विकास से पहले सभी कूप चरण शामिल हैं, एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है जिसके लिए अंडाणु और आसपास के ग्रैनुलोसा कोशिकाओं में तुल्यकालिक रूपात्मक और चयापचय परिवर्तनों की आवश्यकता होती है, जो इन दो सेलप्रकारों 2,3 के बीच तंग संचार द्वारा संचालित होती है। प्रीएंट्राल रोम किसी भी समय अंडाशय में पाए जाने वाले कूपिक इकाइयों के बहुमत का गठन करतेहैं। फॉलिकुलोजेनेसिस के प्रीएंट्रल चरणों के माध्यम से विकास एंट्रल विकास 5,6 की तुलना में कई सप्ताह लंबा होने का अनुमान है, और यह समय अंडाणु और दैहिक कोशिकाओं के लिए विकास के अंतिम चरण (यानी, एंट्रल चरण) में प्रवेश करने के लिए पर्याप्त परिपक्वता प्राप्त करने और ओव्यूलेशन, निषेचन और भ्रूण के विकासके लिए तैयार करने के लिए आवश्यक है।
डिम्बग्रंथि प्रीएंट्राल फॉलिकुलोजेनेसिस के बारे में वर्तमान ज्ञान का अधिकांश हिस्सा माउस मॉडल 10,11,12,13 से आता है, जो एक छोटे और कम रेशेदार अंडाशय से बड़ी संख्या में इन रोम को पुनर्प्राप्त करने में आसानी के कारण होता है। यद्यपि गोजातीय अंडाशय से बड़ी संख्या में प्रीएंट्राल रोम के अलगाव की रिपोर्ट लगभग 30 साल14 साल पुरानी है, इन प्रारंभिक चरण के रोम के विकास को विनियमित करने वाली प्रक्रियाओं के बारे में अधिक पूर्ण समझ अप्राप्य बनी हुई है, बड़े पैमाने पर पर्याप्त संख्या में व्यवहार्य प्रीएंट्राल रोम को पुनः प्राप्त करने के लिए अनुकूलित, कुशल और दोहराने योग्य तरीकों की कमी के कारण, विशेष रूप से विकास के शुरुआती चरणों में। मनुष्यों में सहायक प्रजनन में भविष्य के उपयोग के लिए डिम्बग्रंथि रिजर्व को संरक्षित करने में बढ़ती रुचि के साथ, गायें उनकी अधिक समान डिम्बग्रंथि संरचना के कारण एक आकर्षक मॉडल बन जातीहैं। हालांकि, गोजातीय अंडाशय माउस अंडाशय16 की तुलना में कोलेजन में स्पष्ट रूप से समृद्ध है, जिससे माउस के लिए वर्णित तरीकों का उपयोग करके यांत्रिक अलगाव बहुत अक्षम हो जाता है। प्रजनन संरक्षण तकनीकों का विस्तार करने के प्रयासों में एंट्रल चरण में प्रीएंट्राल रोम का पूर्ण इन विट्रो विकास शामिल है, इसके बाद संलग्न अंडाणुओं की इन विट्रो परिपक्वता (आईवीएम), इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ), और भ्रूण उत्पादन और स्थानांतरण17 शामिल हैं। इस प्रकार, यह पूरी प्रक्रिया केवल चूहों18 में हासिल की गई है। मवेशियों में, विट्रो में कूप विकास की ओर प्रगति संस्कृति की शुरुआत में परिवर्तनीय कूप चरणों के साथ-साथ प्रोटोकॉल17,19 के बीच संस्कृति की परिवर्तनशील लंबाई के साथ कुछ रिपोर्टों तक सीमित है।
गोजातीय अंडाशय से प्रीएंट्राल रोम की फसल के लिए साहित्य में वर्णित विधियों ने ज्यादातर यांत्रिक और एंजाइमैटिक तकनीकों का उपयोग किया है, या तो अलग या संयोजन 2,14,17,20 में। गोजातीय प्रीएंट्राल फॉलिकल अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल की पहली रिपोर्ट ने पूरे अंडाशय20 को संसाधित करने के लिए एक ऊतक होमोजेनाइज़र और सीरियल निस्पंदन का उपयोग किया। इस अध्ययन के बाद यांत्रिक और एंजाइमेटिक प्रक्रियाओं के संयोजन की रिपोर्ट थी जो कोलेजनेज14 का उपयोग करती थी। डिम्बग्रंथि के ऊतकों को पचाने के लिए कोलेजनेज का उपयोग करते समय एक आवर्तक विषय कूप तहखाने झिल्ली के नुकसान के लिए संभावित जोखिम है, जो कूप व्यवहार्यता 14,21,22,23 से समझौता कर सकता है। इसलिए, यांत्रिक तरीकों के विभिन्न संयोजनों को नियोजित किया गया है, जैसे कि ऊतक चॉपर का उपयोग और बार-बार पिपेटिंग या होमोजिनाइजेशन 20,24,25,26 के साथ संयुक्त ऊतक हेलीकॉप्टर। एक अन्य यांत्रिक तकनीक जिसे वर्णित किया गया है, डिम्बग्रंथि के ऊतकों से सीधे प्रीएंट्राल रोम को विच्छेदित करने के लिए सुइयों का उपयोग करती है, जो विशेष रूप से बड़े (>200 μm) द्वितीयक रोम को अलग करने के लिए उपयोगी है। हालांकि, यह प्रक्रिया समय लेने वाली है, छोटे प्रीएंट्राल रोम को अलग करने के लिए अक्षम है, और गोजातीय अंडाशय 19,27,28 में प्रयास किए जाने पर कौशल-निर्भर है।
साहित्य में वर्णित विभिन्न तकनीकों का लाभ उठाते हुए, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एकल गोजातीय अंडाशय से प्रीएंट्राल रोम के अलगाव को सरल, सुसंगत और कुशल तरीके से अनुकूलित करना है जो एंजाइमेटिक समाधानों में इनक्यूबेशन से बचता है। प्रीएंट्राल फॉलिकल्स को अलग करने के तरीकों में सुधार करने से फॉलिकुलोजेनेसिस के इस चरण की समझ को बढ़ाने का अवसर मिलेगा और एंट्रल चरण में प्रीएंट्राल फॉलिकल्स विकसित करने के लिए प्रभावी संस्कृति प्रणालियों के विकास को सक्षम किया जा सकेगा। गोजातीय प्रजातियों जैसे बड़े स्तनपायी से प्रीएंट्राल रोम के अलगाव के लिए यहां वर्णित विस्तृत प्रक्रियाएं शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण होंगी, जो एक गैर-मुराइन प्रजातियों में प्रारंभिक फॉलिकुलोजेनेसिस का अध्ययन करने का लक्ष्य रखती हैं जो मनुष्यों के लिए ट्रांसलेटेबल है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में गोजातीय अंडाशय से प्रारंभिक चरण प्रीएंट्राल रोम, विशेष रूप से प्राथमिक और प्रारंभिक माध्यमिक चरणों में पुनः प्राप्त करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का विवरण ?…
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को आंशिक रूप से यूएसडीए मल्टी-स्टेट प्रोजेक्ट डब्ल्यू 4112 और एसएम को यूसी डेविस जेस्ट्रो शील्ड्स पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
लेखक सभी प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले गोजातीय अंडाशय प्रदान करने के लिए सेंट्रल वैली मीट, इंक की सराहना करना चाहते हैं। लेखक ों ने अंडाशय प्रसंस्करण और कूप अलगाव के साथ सहायता के लिए ओलिविया सिल्वरा को भी धन्यवाद दिया।
5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
#21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |