Isolamento di piccoli follicoli preantrali dall'ovaio bovino utilizzando una combinazione di frammentazione, omogeneizzazione e filtrazione seriale

Summary

L’avanzamento dello studio della follicologenesi preantrale richiede metodi efficienti di isolamento del follicolo dalle singole ovaie. Qui viene presentato un protocollo meccanico semplificato per l’isolamento del follicolo dalle ovaie bovine utilizzando un tritatutto tissutale e un omogeneizzatore. Questo metodo consente la raccolta di un gran numero di follicoli preantrali vitali da una singola ovaia.

Abstract

Comprendere l’intero processo della follicologenesi dei mammiferi è fondamentale per migliorare le tecnologie di riproduzione assistita nel bestiame, negli esseri umani e nelle specie in via di estinzione. La ricerca è stata per lo più limitata ai follicoli antrali e ai grandi follicoli preantrali a causa della difficoltà nell’isolamento dei follicoli preantrali più piccoli, specialmente nei grandi mammiferi come le specie bovine. Questo lavoro presenta un approccio efficiente per recuperare un gran numero di piccoli follicoli preantrali da un singolo ovaio bovino. La corteccia delle singole ovaie bovine è stata tagliata in cubi da 500 μm utilizzando un trinciatutto di tessuto e omogeneizzata per 6 minuti a 9.000-11.000 giri / min utilizzando una sonda da 10 mm. I detriti di grandi dimensioni sono stati separati dall’omogenato usando un panno di formaggio, seguito da una filtrazione seriale attraverso filtri cellulari da 300 μm e 40 μm. Il contenuto trattenuto nel filtro da 40 μm è stato risciacquato in un piatto di ricerca, dove i follicoli sono stati identificati e raccolti in una goccia di mezzo. La vitalità dei follicoli raccolti è stata testata tramite colorazione blu tripano. Questo metodo consente l’isolamento di un gran numero di piccoli follicoli preantrali vitali da un singolo ovaio bovino in circa 90 minuti. È importante sottolineare che questo metodo è interamente meccanico ed evita l’uso di enzimi per dissociare il tessuto, che può danneggiare i follicoli. I follicoli ottenuti utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per applicazioni a valle come l’isolamento dell’RNA per RT-qPCR, l’immunolocalizzazione di proteine specifiche e la coltura in vitro .

Introduction

I follicoli ovarici sono le unità funzionali dell’ovaio, responsabili della produzione del gamete (ovocita) e degli ormoni critici per la funzione riproduttiva e la salute generale. I follicoli primordiali si formano nell’ovaio durante lo sviluppo fetale o nel periodo neonatale a seconda della specie¹ e costituiscono la riserva ovarica di una femmina. La crescita follicolare inizia con l’attivazione dei follicoli primordiali che lasciano il pool di riposo ed entrano nella fase di crescita. La follicologenesi preantrale, che comprende tutti gli stadi follicolari prima dello sviluppo dell’antro, è un processo altamente dinamico che richiede cambiamenti morfologici e metabolici sincroni nell’ovocita e nelle cellule della granulosa circostante, guidati da una stretta comunicazione tra questi due tipi di cellule ^2,3. I follicoli preantrali costituiscono la maggior parte delle unità follicolari presenti nell’ovaio in un dato momento⁴. Lo sviluppo attraverso gli stadi preantrali della follicologenesi è stimato in diverse settimane più lungo dello sviluppo antrale ^5,6, e questo tempo è necessario affinché l’ovocita e le cellule somatiche acquisiscano una maturità sufficiente per entrare nella fase finale di sviluppo (cioè la fase antrale) e prepararsi per l’ovulazione, la fecondazione e lo sviluppo embrionale 7,8,9.

Gran parte delle attuali conoscenze sulla follicologenesi preantrale ovarica proviene dai modelli murini^10,11,12,13, dovuta in parte alla facilità nel recuperare un gran numero di questi follicoli da un ovaio più piccolo e meno fibroso. Sebbene le segnalazioni di isolamento di un gran numero di follicoli preantrali dalle ovaie bovine risalgano a circa 30 anni¹⁴, una comprensione più completa dei processi che regolano lo sviluppo di questi follicoli in fase iniziale è rimasta irrealizzata, in gran parte a causa della mancanza di metodi ottimizzati, efficienti e ripetibili per recuperare un numero sufficiente di follicoli preantrali vitali, in particolare nelle prime fasi dello sviluppo. Con il crescente interesse a preservare la riserva ovarica per un uso futuro nella riproduzione assistita nell’uomo, le mucche diventano un modello attraente grazie alla loro struttura ovarica più simile¹⁵. Tuttavia, l’ovaio bovino è marcatamente più ricco di collagene rispetto all’ovaio di topo¹⁶, rendendo l’isolamento meccanico utilizzando i metodi descritti per il topo molto inefficiente. Gli sforzi per espandere le tecniche di conservazione della fertilità includono la crescita completa in vitro dei follicoli preantrali allo stadio antrale, seguita dalla maturazione in vitro (IVM) degli ovociti chiusi, dalla fecondazione in vitro (IVF) e dalla produzione e trasferimento di embrioni¹⁷. Finora, l’intero processo è stato raggiunto solo nei topi¹⁸. Nei bovini, il progresso verso la crescita del follicolo in vitro è limitato a pochi rapporti con stadi follicolari variabili all’inizio della coltura, così come lunghezza variabile della coltura tra i protocolli^17,19.

I metodi descritti in letteratura per il prelievo di follicoli preantrali dall’ovaio bovino hanno utilizzato principalmente tecniche meccaniche ed enzimatiche, isolate o in combinazione 2,14,17,20. Il primo rapporto di un protocollo per l’isolamento del follicolo preantrale bovino ha utilizzato un omogeneizzatore tissutale e una filtrazione seriale per elaborare le ovaie intere²⁰. Questo studio è stato seguito da rapporti che combinano procedure meccaniche ed enzimatiche che utilizzavano la collagenasi¹⁴. Un tema ricorrente quando si utilizza la collagenasi per digerire il tessuto ovarico è il potenziale rischio di danni alla membrana basale follicolare, che può compromettere la vitalità del follicolo 14,21,22,23. Pertanto, sono state impiegate diverse combinazioni di metodi meccanici, come l’uso di un trinciatutto e pipettaggio ripetuto o di un trinciatutto combinato con omogeneizzazione^20,24,25,26. Un’altra tecnica meccanica che è stata descritta utilizza aghi per sezionare i follicoli preantrali direttamente dal tessuto ovarico, che è particolarmente utile per isolare follicoli secondari più grandi (>200 μm). Tuttavia, questo processo richiede tempo, è inefficiente per isolare i follicoli preantrali più piccoli ed è dipendente dalle competenze quando viene tentato nelle ovaie bovine 19,27,28.

Sfruttando le diverse tecniche descritte in letteratura, questo protocollo mirava a ottimizzare l’isolamento dei follicoli preantrali dalle singole ovaie bovine in modo semplice, coerente ed efficiente che eviti l’incubazione in soluzioni enzimatiche. Il miglioramento dei metodi per isolare i follicoli preantrali fornirà l’opportunità di migliorare la comprensione di questo stadio della follicologenesi e consentirà lo sviluppo di sistemi di coltura efficaci per sviluppare follicoli preantrali allo stadio antrale. Le procedure dettagliate qui descritte per l’isolamento dei follicoli preantrali da un grande mammifero come la specie bovina saranno vitali per i ricercatori che mirano a studiare la follicologenesi precoce in una specie non murina che è traducibile per l’uomo.

Protocol

Le ovaie bovine (Bos taurus) sono state prelevate da un mattatoio locale e trasportate al laboratorio entro 6 ore dalla raccolta. A causa del gran numero di animali lavorati nella struttura, l’età, la razza e lo stadio del ciclo di estro degli animali sono sconosciuti. Poiché in questi esperimenti non sono stati utilizzati animali vivi, non è stato richiesto un protocollo approvato per la cura e l’uso degli animali. 1. Preparazione delle attrezzature e dei reagenti</…

Representative Results

Panoramica e passaggi criticiUtilizzando questo protocollo, i piccoli follicoli preantrali bovini possono essere isolati in modo affidabile dalle singole ovaie in numeri sperimentalmente rilevanti. Da un totale di 30 repliche, sono stati ottenuti in media 41 follicoli per replica, con un intervallo da 11 a 135 follicoli (Figura 4A). In 14 repliche, i follicoli sono stati caratterizzati per lo stadio di sviluppo come precedentemente descritto26 mis…

Discussion

Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile per recuperare i follicoli preantrali in fase iniziale, in particolare nelle fasi primarie e secondarie, dall’ovaio bovino. Questo protocollo si basa sui precedenti rapporti 20,25,30,34,35,36 e fornisce ottimizzazioni che si traducono nell’isolamento di un numero significativo di follicoli da una singola ovaia.^…

Materials

5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette	Duran Wheaton Kimble	63A54	Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining
20 mL Luer-lock Syringe	Fisher Scientific	Z116882-100EA	Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
#21 Sterile Scalpel Blade	Fisher Scientific	50-365-023	Used to cut the ovaries and remove the medula
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-547	Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer
104 mm Plastic Funnel	Fisher Scientific	10-348C	Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over
300 μm Cell Strainer	pluriSelect	43-50300-03	Used to filter the filtrate from the cheese cloth
500 mL Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	FB500500	Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth
Air-Tite Sterile Needles 18 G	Thermo Fisher Scientific	14-817-151	18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm	Fisher Scientific	14-817-171	Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck
BD Hoechst 33342 Solution	Fisher Scientific	BDB561908	Fluorescent DNA stain
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G	Component of follicle wash media
Cheese Cloth	Electron Microscopy Sciences	71748-00	First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris
Classic Double Edge Safety Razor Blades	Wilkinson Sword	N/A	Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunostaining
Eisco Latex Pipette Bulbs	Fisher Scientific	S29388	Rubber bulb to use with Pasteur pipettes
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H3375	Component of follicle wash media
Homogenizer	VWR	10032-336	Homogenize the ovarian tissue to release follicles
ImageJ/Fiji	NIH	v2.3.1	Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10184	Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization
Microscope – Stereoscope	Olympus	SZX2-ILLT	Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate
Microscope – Inverted	Nikon	Diaphot 300	Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles
Microscope – Inverted	ECHO	Revolve R4	Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410-1L	Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching
Non-essential Amino Acids (NEAA)	Gibco	11140-050	Component of follicle wash medium
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-001	Reagent for immunostaining blocking buffer
Nunc 4-well Dishes for IVF	Thermo Fisher Scientific	144444	4-well dishes for follicle isolation and washing
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Gibco	15-140-122	Component of follicle wash medium
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm	Ted Pella	10184-04	Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP665-1	Washing buffer for ovaries and follicles
Plastic Cutting Board	Fisher Scientific	09-002-24A	Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries
Polyvinylpyrrolidone (PVP)	Fisher Scientific	BP431-100	Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue
Qiagen RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA column clean-up kit
R	The R Foundation	v4.1.2	Statistical analysis software
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody	Abcam	ab181701	Cx37 primary antibody for immunostaining
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	K1691	cDNA synthesis kit
Rstudio	RStudio, PBC	v2021.09.2	Statistical analysis software
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified)	Fisher Scientific	SS266-1	Used to increase media pH to 7.6-7.8
Sodium Pyruvate (NaPyr)	Gibco	11360-070	Component of follicle wash medium
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm	Thermo Fisher Scientific	60872-310	Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725271	Mastermix for PCR reaction
Steritop Threaded Bottle Top Filter	Sigma-Aldrich	S2GPT02RE	Used to sterilize follicle wash medium
SYBR-safe DNA gel stain	Thermo Fisher Scientific	S33102	Staining to visual PCR products on agarose gel
TCM199 with Hank’s Salts	Gibco	12-350-039	Component of follicle wash medium
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergent for immunostaining permeabilization buffer
Trizol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	RNA isolation reagent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15-250-061	Used for testing viability of isolated follicles
Tween 20			Detergent for immunostaining wash buffer
Warmer Plate Universal	WTA	20931	Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope
Wiretrol II Calibrated Micropipets	Drummond	50002-005	Glass micropipettes to manipulate follicles