フラグメンテーション、ホモジナイズ、および連続ろ過の組み合わせを使用したウシ卵巣からの小さな前胞卵胞の分離
Summary
前胞形成の研究を進めるには、単一の卵巣から卵胞を分離する効率的な方法が必要です。ここに提示されているのは、組織チョッパーとホモジナイザーを使用してウシの卵巣から卵胞を分離するための合理化された機械的プロトコルです。この方法は、単一の卵巣から多数の生存可能な前胞卵胞の収集を可能にする。
Abstract
哺乳類の卵胞形成の全過程を理解することは、家畜、ヒト、絶滅危惧種の生殖補助医療を向上させるために重要です。研究は、特にウシ種などの大型哺乳類では、より小さな前胞状卵胞の分離が困難であるため、主に前胞状および大型前胞状卵胞に限定されてきました。この研究は、単一のウシ卵巣から多数の小さな前胞胞を回収するための効率的なアプローチを提示します。個々のウシ卵巣の皮質を組織チョッパーを使用して500μmの立方体にスライスし、10mmプローブを使用して9,000〜11,000rpmで6分間ホモジナイズしました。大きな破片をチーズクロスを使用してホモジネートから分離し、続いて300μmおよび40μmのセルストレーナーで連続ろ過しました。40μmストレーナーに保持された内容物を検索皿にすすぎ、そこで卵胞を特定し、一滴の培地に集めた。採取した卵胞の生存率をトリパンブルー染色 により 試験した。この方法では、約90分で単一のウシ卵巣から多数の生存可能な小さな前胞胞を単離することができます。重要なことに、この方法は完全に機械的であり、卵胞を損傷する可能性のある組織を解離するための酵素の使用を回避します。このプロトコルを使用して得られた卵胞は、RT-qPCR用のRNAの単離、特定のタンパク質の免疫局在化、 in vitro 培養などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。
Introduction
卵巣卵胞は卵巣の機能単位であり、配偶子(卵母細胞)の産生、ならびに生殖機能と全体的な健康に重要なホルモンの産生に関与しています。原始卵胞は、種に応じて胎児の発育中または新生児期に卵巣に形成され1、女性の卵巣予備能を構成します。卵胞の成長は、休息プールを離れて成長期に入る原始卵胞の活性化から始まります。前胞形成は、前庭発育前のすべての卵胞段階を網羅し、これら2つの細胞型間の緊密なコミュニケーションによって駆動される、卵母細胞および周囲の顆粒膜細胞の同期形態学的および代謝的変化を必要とする非常に動的なプロセスです2,3。前胞卵胞は、いつでも卵巣に見られる卵胞単位の大部分を構成します4。卵胞形成の前期までの発達は、胞状発達よりも数週間長いと推定されており5,6、この時間は、卵母細胞と体細胞が発達の最終段階(すなわち、胞状段階)に入るのに十分な成熟を獲得し、排卵、受精、および胚発生の準備をするために必要な7,8,9。
卵巣前胞卵胞形成に関する現在の知識の多くは、マウスモデル10、11、12、13から来ており、これは、より小さく、線維性の低い卵巣からこれらの卵胞を多数回収することが容易であることに一部起因しています。ウシの卵巣から多数の前胞胞が分離されたという報告は約30年前にさかのぼりますが14、これらの初期段階の卵胞の発達を調節するプロセスに関するより完全な理解は、主に、特に発生の初期段階で、十分な数の生存可能な前胞卵胞を回収するための最適化され、効率的で、再現性のある方法がないため、実現されていません。ヒトの生殖補助医療における将来の使用のために卵巣予備能を保存することへの関心が高まるにつれ、牛は卵巣構造がより類似しているため、魅力的なモデルになります15。しかし、ウシ卵巣はマウス卵巣16と比較してコラーゲンが著しく豊富であり、マウスについて記載された方法を用いた機械的単離は非常に非効率的である。生殖能力保存技術を拡大するための努力には、前胞卵胞の胞状段階への完全なin vitro成長、それに続く囲まれた卵母細胞の体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)、および胚の生産と移植が含まれます17。これまでのところ、このプロセス全体はマウス18でのみ達成されています。ウシでは、in vitroでの卵胞成長への進行は、培養開始時の卵胞段階が変動し、プロトコル間の培養の長さが変動するいくつかの報告に限定されています17,19。
ウシ卵巣からの前胞卵胞の収穫のための文献に記載されている方法は、単離または組み合わせて、機械的および酵素的技術を主に使用してきた2,14,17,20。ウシ前胞卵胞単離のためのプロトコルの最初の報告では、組織ホモジナイザーと連続ろ過を使用して卵巣全体を処理しました20。この研究に続いて、コラゲナーゼ14を利用した機械的手順と酵素的手順を組み合わせた報告が続きました。卵巣組織を消化するためにコラゲナーゼを利用する際の繰り返しのテーマは、卵胞の生存率を損なう可能性のある卵胞基底膜の損傷の潜在的なリスクです14,21,22,23。したがって、組織チョッパーと繰り返しピペッティングの使用、または均質化と組み合わせた組織チョッパーの使用など、機械的方法のさまざまな組み合わせが採用されてきました20、24、25、26。記載されている別の機械的技術は、針を利用して卵巣組織から直接前胞卵胞を解剖し、これはより大きな(>200μm)二次卵胞を単離するのに特に有用である。ただし、このプロセスは時間がかかり、より小さな前胞卵胞を分離するには非効率的であり、ウシの卵巣で試みた場合のスキルセットに依存します19,27,28。
文献に記載されているさまざまな技術を利用して、このプロトコルは、酵素溶液でのインキュベーションを回避する、単純で一貫性のある効率的な方法で、単一のウシ卵巣からの前胞卵胞の分離を最適化することを目的としていました。前胞卵胞の単離方法を改善することは、卵胞形成のこの段階の理解を深め、前胞卵胞を前胞期に発達させるための効果的な培養システムの開発を可能にする機会を提供します。ウシ種などの大型哺乳類から前胞卵胞を単離するための本明細書に記載される詳細な手順は、ヒトに翻訳可能な非マウス種における初期の卵胞形成の研究を目指す研究者にとって不可欠であろう。
Protocol
ウシ(Bos taurus)卵巣は地元の食肉処理場から供給され、収集から6時間以内に実験室に輸送されました。施設内で処理される動物の数が多いため、動物の年齢、品種、発情周期の段階は不明です。これらの実験では生きた動物が使用されなかったため、承認された動物の世話と使用のプロトコルは必要ありませんでした。 1.機器と試薬の準備 実験?…
Representative Results
概要と重要な手順このプロトコルを使用すると、小さなウシ前胞胞を実験的に関連する数で単一の卵巣から確実に分離できます。合計30回の反復から、反復あたり平均41個の卵胞が得られ、11〜135個の卵胞の範囲でした(図4A)。14回の反復において、卵胞は、実体顕微鏡下で1μmの顕微鏡キャリブレーションスライドを使用して卵胞直径を測定することによっ…
Discussion
本プロトコルは、ウシ卵巣から、特に一次および初期の二次段階で、初期段階の前胞状卵胞を回収するための再現可能な方法を詳述している。このプロトコルは、以前のレポート20、25、30、34、35、36に基づいており、個々の卵巣から意味のある数の卵?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、USDAマルチステートプロジェクトW4112とカリフォルニア大学デービス校ジャストロシールズ賞によってSMに部分的に資金提供されました。
著者らは、すべての実験で使用されたウシの卵巣を提供してくれたセントラルバレーミート社に感謝の意を表したいと思います。著者らはまた、卵巣処理と卵胞の分離を支援してくれたオリビア・シルベラに感謝します。
Materials
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
Riferimenti
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
- Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
- Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
- Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Biologia dello sviluppo. 279 (1), 20-30 (2005).
- Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
- Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
- Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
- McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
- Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
- Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
- Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
- Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
- Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
- Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
- Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
- Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
- Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
- Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
- Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
- Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
- vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
- Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
- Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
- Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
- Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
- Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
- Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
- Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
- Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
- Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
- Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
- Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the ‘holy grail’ for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
Citazione di questo articolo
McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration. J. Vis. Exp. (187), e64423, doi:10.3791/64423 (2022).