단편화, 균질화 및 연속 여과의 조합을 사용하여 소 난소에서 작은 전방 난포의 분리
Summary
전후 난포 생성에 대한 연구를 발전시키기 위해서는 단일 난소에서 난포를 분리하는 효율적인 방법이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 조직 초퍼와 균질화를 사용하여 소 난소에서 난포를 분리하기위한 간소화 된 기계적 프로토콜입니다. 이 방법은 단일 난소에서 많은 수의 생존 가능한 전방 난포를 수집 할 수있게합니다.
Abstract
포유류 모낭 생성의 전체 과정을 이해하는 것은 가축, 인간 및 멸종 위기에 처한 종의 보조 생식 기술을 개선하는 데 중요합니다. 연구는 특히 소 종과 같은 대형 포유류에서 더 작은 전방 모낭의 분리가 어렵 기 때문에 대부분 전방 및 큰 전방 모낭으로 제한되었습니다. 이 연구는 단일 소 난소에서 많은 수의 작은 전방 난포를 회수하는 효율적인 접근 방식을 제시합니다. 개별 소 난소의 피질을 조직 초퍼를 사용하여 500μm 입방체로 절단하고 10mm 프로브를 사용하여 9,000-11,000rpm에서 6분 동안 균질화했습니다. 큰 파편은 치즈 천을 사용하여 균질액으로부터 분리하고, 이어서 300 μm 및 40 μm 세포 스트레이너를 통한 연속 여과하였다. 40μm 스트레이너에 남아있는 내용물을 검색 접시로 헹구어 모낭을 식별하고 배지 한 방울로 수집했습니다. 수집된 모낭의 생존력은 트리판 블루 염색을 통해 시험하였다. 이 방법은 약 90 분 안에 단일 소 난소에서 많은 수의 생존 가능한 작은 preantral 난포를 분리 할 수 있습니다. 중요하게도,이 방법은 완전히 기계적이며 모낭을 손상시킬 수있는 조직을 해리하기 위해 효소를 사용하지 않습니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 난포는 RT-qPCR을 위한 RNA 분리, 특정 단백질의 면역 국소화 및 시험관 내 배양과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
Introduction
난소 난포는 난소의 기능 단위로, 배우자 (난 모세포)의 생산뿐만 아니라 생식 기능과 전반적인 건강에 중요한 호르몬을 담당합니다. 원시 난포는 태아 발달 중 또는 종1에 따라 신생아기에 난소에서 형성되며 여성의 난소 예비를 구성합니다. 여포 성장은 휴식 풀을 떠나 성장 단계로 들어가는 원시 모낭의 활성화로 시작됩니다. 전두엽 발달 이전의 모든 난포 단계를 포함하는 전안구 모낭 생성은 이 두 세포 유형 2,3 간의 긴밀한 통신에 의해 구동되는 난모세포와 주변 과립막 세포에서 동기식 형태학적 및 대사적 변화를 필요로 하는 매우 역동적인 과정입니다. Preantral 난포는 주어진 시간에 난소에서 발견되는 난포 단위의 대부분을 구성합니다4. 난포 발달 전 단계를 통한 발달은 전방 발달5,6보다 몇 주 더 긴 것으로 추정되며, 이 시기는 난모세포와 체세포가 발달의 최종 단계(즉, 항문 단계)에 진입하고 배란, 수정 및 배아 발달을 준비하기에 충분한 성숙을 얻는 데 필요합니다7,8,9.
난소 전 난포 형성에 대한 현재 지식의 대부분은 마우스 모델10,11,12,13에서 비롯되며, 이는 부분적으로 더 작고 섬유질이 적은 난소에서 많은 수의 난포를 쉽게 회복 할 수 있기 때문입니다. 소 난소에서 많은 수의 전방 난포를 분리했다는 보고는 약 30년 전으로 거슬러 올라갑니다.14, 이러한 초기 단계의 난포의 발달을 조절하는 과정에 대한 보다 완전한 이해는 실현되지 않은 상태로 남아 있습니다., 특히 발달 초기 단계에서 충분한 수의 생존 가능한 전두엽 난포를 회수할 수 있는 최적화되고 효율적이며 반복 가능한 방법이 부족하기 때문입니다. 인간의 보조 생식에 대한 미래의 사용을 위해 난소 예비력을 보존하는 것에 대한 관심이 증가함에 따라, 소는 더 유사한 난소 구조15로 인해 매력적인 모델이됩니다. 그러나, 소 난소는 마우스 난소16에 비해 콜라겐이 현저히 풍부하여, 마우스에 대해 기술된 방법을 사용한 기계적 분리를 매우 비효율적으로 만든다. 생식력 보존 기술을 확장하기 위한 노력에는 전안구 난포의 완전한 시험관 내 성장, 밀폐된 난모세포의 시험관 내 성숙(IVM), 체외 수정(IVF), 배아 생산 및 이식이 포함됩니다17. 지금까지, 이 전체 과정은 마우스18에서만 달성되었다. 소에서, 시험관 내에서 난포 성장을 향한 진전은 배양 시작시 가변 난포 단계와 프로토콜17,19 사이의 다양한 배양 기간을 갖는 몇 가지 보고서로 제한됩니다.
소 난소에서 preantral 난포의 수확을위한 문헌에 설명 된 방법은 대부분 분리 또는 조합된 기계적 및 효소 기술을 사용했습니다 2,14,17,20. 소 전신난포 분리를 위한 프로토콜의 첫 번째 보고는 전체 난소를 처리하기 위해 조직 균질화기 및 직렬 여과를 사용하였다20. 이 연구는 콜라게나제14를 활용한 기계적 및 효소적 절차를 결합한 보고로 이어졌습니다. 난소 조직을 소화하기 위해 콜라게나제를 사용할 때 반복되는 주제는 난포 생존력을 손상시킬 수 있는 난포 기저막의 손상에 대한 잠재적 위험입니다 14,21,22,23. 따라서, 조직 초퍼의 사용 및 반복 피펫팅 또는 균질화20,24,25,26과 결합된 조직 초퍼의 사용과 같은 기계적 방법의 상이한 조합이 사용되었다. 설명된 또 다른 기계적 기술은 바늘을 사용하여 난소 조직에서 직접 전안구 난포를 해부하는데, 이는 더 큰(>200μm) 2차 난포를 분리하는 데 특히 유용합니다. 그러나 이 과정은 시간이 많이 걸리고 더 작은 전엽 난포를 분리하는 데 비효율적이며 소 난소에서 시도할 때 스킬셋에 의존합니다 19,27,28.
문헌에 설명된 다양한 기술을 활용하여 이 프로토콜은 효소 용액에서 배양을 피하는 간단하고 일관되며 효율적인 방식으로 단일 소 난소에서 전후 난포의 분리를 최적화하는 것을 목표로 했습니다. 전방 모낭을 분리하는 방법을 개선하면 이 모낭 형성 단계에 대한 이해를 높이고 전방 난포를 항문 단계로 발전시키는 효과적인 배양 시스템을 개발할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 소 종과 같은 대형 포유동물로부터 전치모낭의 단리를 위해 본원에 기재된 상세한 절차는 인간에게 번역될 수 있는 비뮤린 종에서 초기 모낭 발생을 연구하고자 하는 연구자에게 필수적일 것이다.
Protocol
소(Bos taurus) 난소는 지역 도축장에서 공급되어 수집 후 6시간 이내에 실험실로 이송되었습니다. 시설에서 처리되는 동물의 수가 많기 때문에 동물의 나이, 품종 및 발정주기의 단계를 알 수 없습니다. 이 실험에는 살아있는 동물이 사용되지 않았기 때문에 승인 된 동물 관리 및 사용 프로토콜이 필요하지 않았습니다. 1. 장비 및 시약 준비 실험실 벤?…
Representative Results
개요 및 중요 단계이 프로토콜을 사용하면 작은 소 preantral 난포를 실험적으로 관련된 숫자로 단일 난소에서 안정적으로 분리 할 수 있습니다. 총 30 번의 반복에서 복제 당 평균 41 개의 난포가 얻어졌으며 범위는 11-135 개입니다 (그림 4A). 14번의 반복에서, 모낭은 실체현미경 하에 1 μm 현미경 보정 슬라이드를 사용하여 난포 직경을 측정함으로써 앞서<sup class="…
Discussion
본 프로토콜은 소 난소로부터 초기 단계의 preantral 난포, 특히 1 차 및 초기 2 차 단계에서 회수하는 재현 가능한 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 이전 보고서 20,25,30,34,35,36을 기반으로 하며 개별 난소에서 의미 있는 수의 난포를 분리하는 최적화를 제공합니다.<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 USDA 다중 상태 프로젝트 W4112와 UC Davis Jastro Shields 상을 SM에 의해 부분적으로 자금을 지원받았습니다.
저자는 모든 실험에 사용 된 소 난소를 제공 한 Central Valley Meat, Inc.에 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 또한 난소 처리 및 난포 분리에 대한 도움을 준 Olivia Silvera에게 감사드립니다.
Materials
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration. J. Vis. Exp. (187), e64423, doi:10.3791/64423 (2022).