Isolering av små preantrala folliklar från nötkreaturäggstocken med hjälp av en kombination av fragmentering, homogenisering och seriell filtrering

Summary

Att främja studien av preantral follikulogenes kräver effektiva metoder för follikelisolering från enstaka äggstockar. Här presenteras ett strömlinjeformat, mekaniskt protokoll för follikelisolering från nötkreatur äggstockar med hjälp av en vävnadshackare och homogenisator. Denna metod möjliggör insamling av ett stort antal livskraftiga preantrala folliklar från en enda äggstock.

Abstract

Att förstå hela processen för däggdjursfollikulogenes är avgörande för att förbättra assisterad reproduktionsteknik hos boskap, människor och hotade arter. Forskningen har mestadels begränsats till antrala och stora preantrala folliklar på grund av svårigheter att isolera mindre preantrala folliklar, särskilt hos stora däggdjur som nötkreatur. Detta arbete presenterar ett effektivt tillvägagångssätt för att hämta ett stort antal små preantrala folliklar från en enda bovin äggstock. Cortex hos enskilda nötkreaturs äggstockar skivades i 500 μm kuber med hjälp av en vävnadshackare och homogeniserades i 6 minuter vid 9 000-11 000 rpm med en 10 mm sond. Stora skräp separerades från homogenatet med hjälp av en ostduk, följt av seriell filtrering genom 300 μm och 40 μm cellsilar. Innehållet som fanns kvar i 40 μm-silen sköljdes i en sökskål, där folliklar identifierades och samlades in i en droppe medium. Livskraften hos de uppsamlade folliklarna testades via trypanblå färgning. Denna metod möjliggör isolering av ett stort antal livskraftiga små preantrala folliklar från en enda nötkreaturs äggstock på cirka 90 minuter. Det är viktigt att denna metod är helt mekanisk och undviker användning av enzymer för att dissociera vävnaden, vilket kan skada folliklarna. Folliklarna erhållna med användning av detta protokoll kan användas för nedströms applikationer såsom isolering av RNA för RT-qPCR, immunolokalisering av specifika proteiner och in vitro-odling .

Introduction

Äggstocksfolliklar är de funktionella enheterna i äggstocken, som ansvarar för produktionen av könscellen (äggcellen) samt hormoner som är kritiska för reproduktiv funktion och allmän hälsa. Primordiala folliklar bildas i äggstocken under fostrets utveckling eller under neonatalperioden beroende på art¹, och de utgör en kvinnas äggstocksreserv. Follikulär tillväxt börjar med aktivering av primordiala folliklar som lämnar vilopoolen och går in i odlingsfasen. Preantral follikulogenes, som omfattar alla follikelstadier före antrumutveckling, är en mycket dynamisk process som kräver synkrona morfologiska och metaboliska förändringar i äggcellen och de omgivande granulosacellerna, drivna av tät kommunikation mellan dessa två celltyper ^2,3. Preantrala folliklar utgör majoriteten av de follikulära enheter som finns i äggstocken vid varje given tidpunkt⁴. Utveckling genom de preantrala stadierna av follikulogenes uppskattas vara flera veckor längre än antral utveckling ^5,6, och denna tid är nödvändig för att oocyten och somatiska celler ska få tillräcklig mognad för att gå in i det sista utvecklingsstadiet (dvs. antralstadiet) och förbereda sig för ägglossning, befruktning och embryonal utveckling 7,8,9.

Mycket av den nuvarande kunskapen om ovariell preantral follikulogenes kommer från musmodeller^10,11,12,13, delvis på grund av lättheten att återhämta ett stort antal av dessa folliklar från en mindre och mindre fibrös äggstock. Även om rapporter om isolering av ett stort antal preantrala folliklar från nötkreaturs äggstockar går tillbaka cirka 30 år¹⁴, har en mer fullständig förståelse för de processer som reglerar utvecklingen av dessa folliklar i tidigt stadium förblivit orealiserad, till stor del på grund av bristen på optimerade, effektiva och repeterbara metoder för att hämta tillräckligt antal livskraftiga preantrala folliklar, särskilt i tidiga utvecklingsstadier. Med det ökande intresset för att bevara äggstocksreserven för framtida användning vid assisterad befruktning hos människor blir kor en attraktiv modell på grund av deras mer liknande äggstocksstruktur¹⁵. Den bovina äggstocken är dock markant rikare på kollagen jämfört med musens äggstock¹⁶, vilket gör mekanisk isolering med metoder som beskrivs för musen mycket ineffektiva. Ansträngningar för att utöka fertilitetsbevarande tekniker inkluderar fullständig in vitro-tillväxt av preantrala folliklar till antralstadiet, följt av in vitro-mognad (IVM) av de slutna oocyterna, in vitro-befruktning (IVF) och embryoproduktion och överföring¹⁷. Hittills har hela denna process endast uppnåtts hos möss¹⁸. Hos nötkreatur är framstegen mot follikeltillväxt in vitro begränsad till några rapporter med varierande follikelstadier i början av kulturen, liksom varierande kulturlängd mellan protokoll^17,19.

De metoder som beskrivs i litteraturen för skörd av preantrala folliklar från nötkreaturs äggstock har mestadels använt mekaniska och enzymatiska tekniker, antingen isolerade eller i kombination 2,14,17,20. Den första rapporten från ett protokoll för isolering av bovin preantral follikel använde en vävnadshomogenisator och seriell filtrering för att bearbeta hela äggstockarna²⁰. Denna studie följdes av rapporter som kombinerar mekaniska och enzymatiska procedurer som använde kollagenas¹⁴. Ett återkommande tema när man använder kollagenas för att smälta äggstocksvävnaden är den potentiella risken för skador på det follikulära källarmembranet, vilket kan äventyra follikelns livskraft 14,21,22,23. Därför har olika kombinationer av mekaniska metoder använts, såsom användning av en vävnadshackare och upprepad pipettering eller en vävnadshackare i kombination med homogenisering^20,24,25,26. En annan mekanisk teknik som har beskrivits använder nålar för att dissekera preantrala folliklar direkt från äggstocksvävnaden, vilket är särskilt användbart för att isolera större (>200 μm) sekundära folliklar. Denna process är dock tidskrävande, ineffektiv för att isolera mindre preantrala folliklar och är kompetensberoende vid försök i nötkreaturs äggstockar 19,27,28.

Genom att dra nytta av de olika teknikerna som beskrivs i litteraturen syftade detta protokoll till att optimera isoleringen av preantrala folliklar från enstaka nötkreatur äggstockar på ett enkelt, konsekvent och effektivt sätt som undviker inkubation i enzymatiska lösningar. Förbättring av metoderna för att isolera preantrala folliklar kommer att ge möjlighet att förbättra förståelsen för detta stadium av follikulogenes och möjliggöra utveckling av effektiva odlingssystem för att utveckla preantrala folliklar till antralstadiet. De detaljerade förfaranden som beskrivs häri för isolering av preantrala folliklar från ett stort däggdjur som nötkreatur kommer att vara avgörande för forskare som syftar till att studera tidig follikulogenes hos en icke-murin art som kan översättas till människor.

Protocol

Nötkreatur (Bos taurus) äggstockar hämtades från ett lokalt slakteri och transporterades till laboratoriet inom 6 timmar efter insamling. På grund av det stora antalet djur som bearbetas i anläggningen är ålder, ras och stadium av djurens estruscykel okända. Eftersom inga levande djur användes i dessa experiment krävdes inget godkänt protokoll för djurvård och användning. 1. Beredning av utrustning och reagenser Täck en 2 fot bred del av en l…

Representative Results

Översikt och kritiska stegMed hjälp av detta protokoll kan små bovina preantrala folliklar isoleras på ett tillförlitligt sätt från enstaka äggstockar i experimentellt relevanta antal. Från totalt 30 replikat erhölls i genomsnitt 41 folliklar per replikat, med ett intervall på 11 till 135 folliklar (figur 4A). I 14 replikat karakteriserades folliklarna för utvecklingsstadium som tidigare beskrivits26 genom att mäta follikeldiametern m…

Discussion

Detta protokoll beskriver en reproducerbar metod för att hämta preantrala folliklar i tidigt stadium, särskilt i primära och tidiga sekundära stadier, från bovin äggstock. Detta protokoll bygger på tidigare rapporter 20,25,30,34,35,36 och ger optimeringar som resulterar i isolering av ett meningsfullt antal folliklar från en enskild äggstock.^</s…

Materials

5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette	Duran Wheaton Kimble	63A54	Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining
20 mL Luer-lock Syringe	Fisher Scientific	Z116882-100EA	Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
#21 Sterile Scalpel Blade	Fisher Scientific	50-365-023	Used to cut the ovaries and remove the medula
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-547	Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer
104 mm Plastic Funnel	Fisher Scientific	10-348C	Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over
300 μm Cell Strainer	pluriSelect	43-50300-03	Used to filter the filtrate from the cheese cloth
500 mL Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	FB500500	Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth
Air-Tite Sterile Needles 18 G	Thermo Fisher Scientific	14-817-151	18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm	Fisher Scientific	14-817-171	Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck
BD Hoechst 33342 Solution	Fisher Scientific	BDB561908	Fluorescent DNA stain
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G	Component of follicle wash media
Cheese Cloth	Electron Microscopy Sciences	71748-00	First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris
Classic Double Edge Safety Razor Blades	Wilkinson Sword	N/A	Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunostaining
Eisco Latex Pipette Bulbs	Fisher Scientific	S29388	Rubber bulb to use with Pasteur pipettes
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H3375	Component of follicle wash media
Homogenizer	VWR	10032-336	Homogenize the ovarian tissue to release follicles
ImageJ/Fiji	NIH	v2.3.1	Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10184	Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization
Microscope – Stereoscope	Olympus	SZX2-ILLT	Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate
Microscope – Inverted	Nikon	Diaphot 300	Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles
Microscope – Inverted	ECHO	Revolve R4	Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410-1L	Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching
Non-essential Amino Acids (NEAA)	Gibco	11140-050	Component of follicle wash medium
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-001	Reagent for immunostaining blocking buffer
Nunc 4-well Dishes for IVF	Thermo Fisher Scientific	144444	4-well dishes for follicle isolation and washing
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Gibco	15-140-122	Component of follicle wash medium
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm	Ted Pella	10184-04	Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP665-1	Washing buffer for ovaries and follicles
Plastic Cutting Board	Fisher Scientific	09-002-24A	Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries
Polyvinylpyrrolidone (PVP)	Fisher Scientific	BP431-100	Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue
Qiagen RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA column clean-up kit
R	The R Foundation	v4.1.2	Statistical analysis software
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody	Abcam	ab181701	Cx37 primary antibody for immunostaining
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	K1691	cDNA synthesis kit
Rstudio	RStudio, PBC	v2021.09.2	Statistical analysis software
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified)	Fisher Scientific	SS266-1	Used to increase media pH to 7.6-7.8
Sodium Pyruvate (NaPyr)	Gibco	11360-070	Component of follicle wash medium
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm	Thermo Fisher Scientific	60872-310	Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725271	Mastermix for PCR reaction
Steritop Threaded Bottle Top Filter	Sigma-Aldrich	S2GPT02RE	Used to sterilize follicle wash medium
SYBR-safe DNA gel stain	Thermo Fisher Scientific	S33102	Staining to visual PCR products on agarose gel
TCM199 with Hank’s Salts	Gibco	12-350-039	Component of follicle wash medium
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergent for immunostaining permeabilization buffer
Trizol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	RNA isolation reagent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15-250-061	Used for testing viability of isolated follicles
Tween 20			Detergent for immunostaining wash buffer
Warmer Plate Universal	WTA	20931	Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope
Wiretrol II Calibrated Micropipets	Drummond	50002-005	Glass micropipettes to manipulate follicles