Sterilizzazione con radiazioni gamma a basso dosaggio per innesti tracheali decellularizzati
Summary
Ottenere la sterilizzazione è essenziale per il trapianto di tessuto tracheale. Qui presentiamo un protocollo di sterilizzazione che utilizza l’irradiazione gamma a basso dosaggio che è completamente tollerato dagli organi.
Abstract
Uno dei principali aspetti chiave per garantire che un trapianto si evolva correttamente è la sterilità del terreno. Il trapianto tracheale decellularizzato comporta l’impianto di un organo che era originariamente a contatto con l’ambiente, quindi non essendo sterile fin dall’inizio. Mentre il protocollo di decellularizzazione (attraverso l’esposizione di detergenti [2% di sodio dodecilsolfato], agitazione continua e shock osmotici) è condotto in linea con misure asettiche, non prevede la sterilizzazione. Pertanto, una delle sfide principali è garantire la sterilità prima dell’impianto in vivo . Sebbene esistano protocolli di sterilizzazione con radiazioni gamma stabiliti per i materiali inorganici, non esistono tali misure per i materiali organici. Inoltre, i protocolli in vigore per i materiali inorganici non possono essere applicati ai materiali organici, poiché la dose di radiazioni stabilita (25 kGy) distruggerebbe completamente l’impianto. Questo articolo studia l’effetto di una dose di radiazioni aumentata in una trachea di coniglio decellularizzata. Abbiamo mantenuto l’intervallo di dosaggio (kGy) e testato dosi aumentate fino a trovare la dose minima alla quale si ottiene la sterilizzazione. Dopo aver determinato la dose, ne abbiamo studiato gli effetti sull’organo, sia istologicamente che biomeccanicamente. Abbiamo determinato che mentre 0,5 kGy non hanno raggiunto la sterilità, dosi di 1 kGy e 2 kGy lo hanno fatto, con 1 kGy, quindi, essendo la dose minima necessaria per ottenere la sterilizzazione. Gli studi microscopici non hanno mostrato cambiamenti rilevanti rispetto agli organi non sterilizzati. Le caratteristiche biomeccaniche assiali non sono state affatto alterate ed è stata osservata solo una leggera riduzione della forza per unità di lunghezza che l’organo può tollerare radialmente. Possiamo quindi concludere che 1 kGy raggiunge la completa sterilizzazione della trachea di coniglio decellularizzata con effetti minimi, se non nulli, sull’organo.
Introduction
La sterilizzazione di un impianto è un requisito fondamentale per la sua vitalità; Infatti, le protesi che si sono dimostrate efficaci sono quelle impiantate in zone sterili (vasi sanguigni, cuore, ossa, ecc.) 1. La trachea ha due superfici: una superficie a contatto con l’ambiente esterno, che quindi non è sterile, e una superficie verso il mediastino, che è sterile. Pertanto, dal momento in cui la trachea viene estratta, non è un organo sterile. Nonostante il successivo processo di decellularizzazione venga effettuato in condizioni di massima sterilità, non si tratta di una fase di sterilizzazione2. L’impianto di materiale estraneo comporta di per sé un rischio di infezione dovuto al microambiente probatterico che produce3e un rischio fino allo 0,014% di trasmissione della malattia dal donatore al ricevente, anche se il materiale è stato sterilizzato4. Per garantire una corretta vascolarizzazione della trachea, in quasi tutti i protocolli sperimentali di trapianto, viene prima sottoposto a impianto eterotopico 5,6,7 in una zona sterile (muscolo, fascia, omento, sottocutaneo, ecc.); Questo perché l’impianto di un elemento non sterile in questo mezzo porterebbe all’infezione dell’area3.
Ci sono una serie di possibili strategie per ottenere un impianto sterile. L’uso di CO2supercritico ha raggiunto la sterilizzazione terminale 8,9. Altri metodi, come la radiazione ultravioletta o il trattamento con sostanze come acido peracetico, etanolo, perossido di ossigeno e acqua elettrolizzata, hanno ottenuto percentuali di successo diverse nella sterilizzazione, quasi sempre a seconda dei loro dosaggi, ma hanno dimostrato di influenzare le caratteristiche biomeccaniche degli impianti. In effetti, alcune sostanze, come l’ossido di etilene, possono modificare sostanzialmente la struttura della matrice impiantata e possono persino causare effetti immunogenici indesiderati. Per questo motivo, molte di queste strategie non possono essere applicate ai modelli biologici 2,10,11,12,13.
La strategia di sterilizzazione più studiata e accettata è quella stabilita dalla norma ISO 11737-1:2006 per la sterilizzazione di dispositivi medici impiantati nell’uomo, con una dose di radiazioni gamma di 25 kGy. Tuttavia, questo regolamento si concentra solo sulla sterilizzazione di elementi inerti e non biologici14,15. Inoltre, le dosi di radioterapia nel trattamento radicale del carcinoma sono inferiori di tre ordini di grandezza rispetto a quelle utilizzate per sterilizzare i dispositivi medici1. Con questo in mente, possiamo concludere che tale dose non solo ucciderebbe il microbiota, ma distruggerebbe e altererebbe radicalmente la struttura biologica dell’impianto. C’è anche la possibilità che generi lipidi residui al momento della degradazione, che possono potenzialmente essere citotossici e accelerare la degradazione enzimatica dello scaffold 13,14,15,16,17, anche quando si utilizzano dosi basse come 1,9 kGy e con danni direttamente proporzionali alla dose di radiazioni ricevuta 17.
Pertanto, l’obiettivo di questo lavoro è cercare di identificare la dose di radiazioni che consente di ottenere un impianto sterile con effetti nocivi minimi causati dall’irradiazione 2,18,19. La strategia che abbiamo seguito prevedeva l’irradiazione di trachee decellularizzate e irradiate a diverse dosi aumentate all’interno di un intervallo di kilogray (0,5, 1, 2, 3 kGy, ecc.), fino a raggiungere una coltura negativa. Ulteriori test sono stati effettuati per quelle dosi che hanno raggiunto colture negative, al fine di confermare la sterilizzazione. Dopo aver determinato la dose minima per ottenere la sterilizzazione, è stato controllato l’impatto strutturale e biomeccanico dell’irradiazione sulla trachea. Tutte le metriche sono state confrontate con le trachee di coniglio native di controllo. La sterilizzazione del costrutto è stata poi testata in vivo impiantando le trachee nei conigli bianchi della Nuova Zelanda.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esistono diverse strategie di sterilizzazione. La CO2supercritica penetra completamente nei tessuti, acidificando il mezzo e decostruendo il doppio strato fosfolipidico cellulare con semplice eliminazione mediante depressurizzazione dell’impianto 8,14,25. È stata utilizzata anche la radiazione ultravioletta ed è stata pubblicata la sua efficacia nella trachea dei roditori, sebbene ci siano solo pochi rapporti in let…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo documento è stato supportato dalla Sovvenzione 2018 della Società Spagnola di Chirurgia Toracica allo Studio Nazionale Multicentrico [Numero 180101 assegnato a Néstor J.Martínez-Hernández] e PI16-01315 [assegnato a Manuel Mata-Roig] dall’Instituto de Salud Carlos III. CIBERER è finanziato dal VI Piano Nazionale R&S&I 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions e dall’Instituto de Salud Carlos III, con l’assistenza del Fondo Europeo di Sviluppo Regionale.
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
Riferimenti
- Ch’ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B. Ultraviolet sterilization in microbiological laboratories. Public Health Reports. 71 (4), 331-336 (1956).
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
