En effektiv rydningsprotokol til undersøgelse af frøudvikling i tomat (Solanum lycopersicum L.)

Summary

Tomatfrøet er en vigtig model til undersøgelse af genetik og udviklingsbiologi under plantegengivelse. Denne protokol er nyttig til rydning af tomatfrø på forskellige udviklingsstadier for at observere den finere embryonale struktur.

Abstract

Tomat (Solanum lycopersicum L.) er en af de største salgsafgrøder på verdensplan. Tomatfrøet er en vigtig model til undersøgelse af genetik og udviklingsbiologi under plantegengivelse. Visualisering af finere embryonal struktur i et tomatfrø hæmmes ofte af frøbelægningslimhinde, flercellelags integument og en tykvægget endosperm, som skal løses ved besværlig indlejringssektion. Et enklere alternativ er at anvende vævsrensningsteknikker, der gør frøet næsten gennemsigtigt ved hjælp af kemiske agenser. Selvom konventionelle rydningsprocedurer giver mulighed for dyb indsigt i mindre frø med en tyndere frøbeklædning, er rydning af tomatfrø fortsat teknisk udfordrende, især i de sene udviklingsstadier.

Præsenteret her er en hurtig og arbejdsbesparende rydningsprotokol for at observere tomatfrøudvikling fra 3 til 23 dage efter blomstring, når embryonal morfologi er næsten færdig. Denne metode kombinerer klorhydratbaseret clearingopløsning, der i vid udstrækning anvendes i Arabidopsis med andre modifikationer, herunder udeladelse af formalin-aceto-alkohol (FAA) fiksering, tilsætning af natriumhypochloritbehandling af frø, fjernelse af den blødgjorte frøbeklædningslimhinde og vask og vakuumbehandling. Denne metode kan anvendes til effektiv rydning af tomatfrø på forskellige udviklingsstadier og er nyttig til fuld overvågning af udviklingsprocessen for mutante frø med god rumlig opløsning. Denne rydningsprotokol kan også anvendes til dyb billeddannelse af andre kommercielt vigtige arter i Solanaceae.

Introduction

Tomat (S. lycopersicum L.) er en af de vigtigste vegetabilske afgrøder rundt om i verden med en produktion på 186,8 millioner tons kødfulde frugter fra 5,1 millioner hektar i 2020¹. Det tilhører den store Solanaceae-familie med omkring 2.716 arter², herunder mange kommercielt vigtige afgrøder som aubergine, peberfrugter, kartoffel og tobak. Den dyrkede tomat er en diploid art (2n = 2x = 24) med en genomstørrelse på ca. 900 Mb³. I lang tid er der gjort en stor indsats for tomat domesticering og avl ved at vælge ønskelige træk fra vilde Solanum spp. Der er over 5.000 tomattiltrædelser opført i Tomato Genetics Resource Center, og mere end 80.000 kimplasmer af tomater opbevares over hele verden⁴. Tomatplanten er flerårig i drivhuset og formeres af frø. Et modent tomatfrø består af tre hovedrum: et fuldvoksent embryo, endosperm af cellulær type og en hård frøbelægning ^5,6 (figur 1A). Efter dobbelt befrugtning går udviklingen af endosperm af cellulær type forud for udviklingen af zygoter. Ved ~ 5-6 dage efter blomstring (DAF) observeres tocellet proembryo først, når endospermen består af seks til otte kerner⁷. I Solanum pimpinellifolium nærmer embryoet sin endelige størrelse efter 20 DAF, og frø er levedygtige til spiring efter 32 DAF⁸. Efterhånden som embryoet udvikler sig, absorberes endospermen gradvist, og kun en lille mængde endosperm forbliver i frøet. Den resterende endosperm består af mikropylar endosperm omkring radikelspidsen og lateral endosperm i resten af frøet ^9,10. Den ydre frøbeklædning er udviklet fra fortykket og lignificeret ydre epidermis af integumentet, og med de døde lag af integumentrester danner de en hård skal for at beskytte embryoet og endospermen⁵.

Figur 1: Skematisk repræsentation af et modent frø i Solanum lycopersicum og Arabidopsis thaliana. (A) Langsgående anatomi af et modent tomatfrø. (B) Langsgående anatomi af et modent Arabidopsisfrø. Et modent tomatfrø er ca. 70 gange større end et Arabidopsisfrø. Skalabjælker = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Produktion af tomatfrø af høj kvalitet afhænger af koordineringen mellem embryoet, endospermen og moderens frøkomponenter¹¹. Dissekering af nøglegener og netværk i frøudvikling kræver en dyb og fuldsporet fænotypisk registrering af mutante frø. Konventionelle indlejrings-sektioneringsteknikker, såsom den halvtynde sektion og paraffinsektionen, anvendes bredt på tomatfrø for at observere de lokale og finere strukturer i embryoet^12,13,14,15. Imidlertid er analyse af frøudviklingen fra tynde sektioner normalt besværlig og mangler z-akse rumlig opløsning. Til sammenligning er vævsrensning en hurtig og effektiv metode til at lokalisere udviklingsstadiet af embryodefekter, der mest sandsynligt vil forekomme¹⁶. Rydningsmetoden reducerer uigennemsigtigheden af internt væv ved at homogenisere brydningsindekset med et eller flere biokemiske midler¹⁶. Helvævsrensning tillader observation af en plantevævsstruktur uden at ødelægge dens integritet, og kombinationen af clearingteknologi og tredimensionel billeddannelse er blevet en ideel løsning til at få information om morfologien og udviklingstilstanden af et planteorgan^17,18. I årenes løb er frørensningsteknikker blevet brugt i forskellige plantearter, herunder Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare og Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Blandt disse har helmonteret ægløsningsteknologi været en effektiv tilgang til at studere frøudvikling af Arabidopsis på grund af dens lille størrelse, 4-5 lag af frøbeklædningscellen og endospermen af nuklear type^24,25. Med den løbende opdatering af forskellige rydningsblandinger, såsom fremkomsten af Hoyers opløsning²⁶, blev de indre strukturer af bygæglet afbildet med en høj grad af klarhed, selvom dets endosperm udgør størstedelen af frøene. Embryogenese af sukkerroer kan observeres ved rydning kombineret med vakuumbehandling og blødgøring med saltsyre¹⁹. I modsætning til ovennævnte arter er der imidlertid ikke rapporteret om embryologiske observationer ved rydning af protokoller i tomatfrø. Dette forhindrer detaljeret undersøgelse af tomaternes embryonale og frøudvikling.

Klorhydrat anvendes almindeligvis som en rydningsopløsning, der gør det muligt at vise de nedsænkede væv og celler på forskellige optiske planer og bevarer i væsentlig grad cellerne eller vævskomponenterne^27,28,29. Klorhydratbaseret clearingprotokol er med succes blevet brugt til helmontering af frø for at observere embryoet og endospermen af Arabidopsis^21,28. Denne rydningsløsning er imidlertid ikke effektiv til at rydde tomatfrø, som er mere uigennemtrængelige end Arabidopsisfrø. De fysiske barrierer omfatter: (1) tomatintegumentet har næsten 20 cellelag ved 3 til 15 DAF 30,31, (2) tomatendospermen er cellulær type, ikke nuklear type³², og (3) tomatfrø er ca. 70 gange større i størrelse^33,34 og (4) producerer store mængder frøbelægningsslimhinde^, som blokerer penetrationen af rydningsreagenser og påvirker visualiseringen af embryoceller.

Derfor præsenterer denne rapport en optimeret klorhydratbaseret rydningsmetode til helmonteringsrensning af tomatfrø på forskellige stadier, hvilket muliggør dyb billeddannelse af embryoudviklingsprocessen (figur 2).

Protocol

1. Fremstilling af opløsninger Forbered FAA-fikseringsmiddel ved at tilsætte 2,5 ml 37% formaldehyd, 2,5 ml iseddike og 45 ml 70% ethanol i et 50 ml centrifugerør. Hvirvel og opbevar den ved 4 °C. Frisklavet FAA-fikseringsmiddel lige før brug.FORSIGTIG: 37% formaldehyd er ætsende og potentielt kræftfremkaldende, hvis det udsættes eller indåndes. Fikseringsmidlet skal udføres i en røghætte, mens du bærer passende personlige værnemidler. Forbered rydningsopløsning ve…

Representative Results

Når tomatfrø blev ryddet ved hjælp af en konventionel metode som i Arabidopsis, blokerede tætte endospermceller visualiseringen af tidlige tomatembryoner ved 3 DAF og 6 DAF (figur 3A, B). Da embryonets samlede volumen steg, kunne et kugleformet embryo næppe skelnes ved 9 DAF (figur 3C). Men da frøstørrelsen fortsatte med at stige, faldt dens permeabilitet, hvilket resulterede i et uklart hjerteembryo ved 12 DAF (<strong class="xf…

Discussion

Sammenlignet med mekanisk sektionering er clearingteknologien mere fordelagtig til tredimensionel billeddannelse, da den bevarer integriteten af plantevæv eller organer¹⁶. Konventionelle rydningsprotokoller er ofte begrænset til små prøver på grund af lettere indtrængning af kemiske opløsninger. Tomatfrø er en problematisk prøve til vævsrensning, fordi den er ca. 70 gange større end et Arabidopsis-frø i størrelse og har flere permeabilitetsbarrierer. Arabidopsis frø…

Materials

1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S