Un protocollo di compensazione efficace per lo studio dello sviluppo delle sementi nel pomodoro (Solanum lycopersicum L.)

Sommario

Il seme di pomodoro è un modello importante per lo studio della genetica e della biologia dello sviluppo durante la riproduzione delle piante. Questo protocollo è utile per eliminare i semi di pomodoro nelle diverse fasi di sviluppo per osservare la struttura embrionale più fine.

Abstract

Il pomodoro (Solanum lycopersicum L.) è una delle principali colture commerciali in tutto il mondo. Il seme di pomodoro è un modello importante per lo studio della genetica e della biologia dello sviluppo durante la riproduzione delle piante. La visualizzazione della struttura embrionale più fine all'interno di un seme di pomodoro è spesso ostacolata dalla mucillagine del rivestimento del seme, dal tegumento multicellulare e da un endosperma a parete spessa, che deve essere risolto con un laborioso sezionamento di incorporamento. Un'alternativa più semplice è quella di impiegare tecniche di pulizia dei tessuti che rendono il seme quasi trasparente usando agenti chimici. Sebbene le procedure di pulizia convenzionali consentano una visione approfondita dei semi più piccoli con un rivestimento di semi più sottile, la pulizia dei semi di pomodoro continua ad essere tecnicamente impegnativa, specialmente nelle ultime fasi di sviluppo.

Qui viene presentato un protocollo di pulizia rapido e laborioso per osservare lo sviluppo dei semi di pomodoro da 3 a 23 giorni dopo la fioritura, quando la morfologia embrionale è quasi completa. Questo metodo combina la soluzione di compensazione a base di cloralio idrato ampiamente utilizzata in Arabidopsis con altre modifiche, tra cui l'omissione della fissazione formalina-aceto-alcol (FAA), l'aggiunta di trattamento ipoclorito di sodio dei semi, la rimozione della mucillagine ammorbidita del rivestimento del seme e il lavaggio e il trattamento sottovuoto. Questo metodo può essere applicato per una pulizia efficiente dei semi di pomodoro in diverse fasi di sviluppo ed è utile nel monitoraggio completo del processo di sviluppo dei semi mutanti con una buona risoluzione spaziale. Questo protocollo di compensazione può anche essere applicato all'imaging profondo di altre specie commercialmente importanti nelle Solanaceae.

Introduzione

Il pomodoro (S. lycopersicum L.) è una delle colture orticole più importanti in tutto il mondo, con una produzione di 186,8 milioni di tonnellate di frutti carnosi da 5,1 milioni di ettari nel 2020¹. Appartiene alla grande famiglia delle Solanacee con circa 2.716 specie², tra cui molte colture commercialmente importanti come melanzane, peperoni, patate e tabacco. Il pomodoro coltivato è una specie diploide (2n = 2x = 24) con una dimensione del genoma di circa 900 Mb³. Per molto tempo, sono stati fatti grandi sforzi verso l'addomesticamento e l'allevamento del pomodoro selezionando tratti ....

Protocollo

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare il fissativo FAA aggiungendo 2,5 ml di formaldeide al 37%, 2,5 ml di acido acetico glaciale e 45 ml di etanolo al 70% in una provetta da centrifuga da 50 ml. Vortex e conservarlo a 4 °C. Preparare il fissativo FAA appena prima dell'uso.
   ATTENZIONE: il 37% di formaldeide è corrosivo e potenzialmente cancerogeno se esposto o inalato. Il fissativo deve essere eseguito in una cappa aspirante indossando adeguati dispositivi di protezione individuale.
2. Preparare la soluzione di pulizia aggiungendo 5 ml di glicerolo al 100%, 40 g di idrato di cloralio e 10 ml di acqua distillata in una bottigli....

Risultati

Quando i semi di pomodoro sono stati eliminati utilizzando un metodo convenzionale come in Arabidopsis, le cellule endospermatiche dense hanno bloccato la visualizzazione dei primi embrioni di pomodoro a 3 DAF e 6 DAF (Figura 3A, B). Con l'aumentare del volume totale dell'embrione, un embrione globulare era appena distinguibile a 9 DAF (Figura 3C). Tuttavia, poiché la dimensione del seme ha continuato ad aumentare, la sua permeabilità è.......

Discussione

Rispetto al sezionamento meccanico, la tecnologia di compensazione è più vantaggiosa per l'imaging tridimensionale in quanto mantiene l'integrità dei tessuti vegetali o degli organi¹⁶. I protocolli di pulizia convenzionali sono spesso limitati a piccoli campioni a causa della più facile penetrazione delle soluzioni chimiche. Il seme di pomodoro è un campione problematico per la pulizia dei tessuti perché è circa 70 volte più grande di un seme di Arabidopsis in termini di dimensioni e ha p.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1.000 µ pipetta a L	GILSON	FA10006M
1.000 µ L puntali per pipette	Corning	T-1000-B
Provetta da centrifuga da 2 ml	Axygen	MCT-200-C
37% formaldeide	DAMAO	685-2013
5.000 &; L pipetta	Eppendorf	3120000275
5.000 &; micro; L puntali per pipette	biosharp	BS-5000-TL
Provetta da centrifuga da 50 ml	Corning	430829
Etanolo assoluto	BOYUAN	678-2002
Bottiglia di vetro	Fisher	FB800-100
Cloralio idrato	Meryer	M13315-100G
Vetrino coprioggetti	Leica	384200
Microscopio DIC	Zeiss	Axio Imager A1	Ingrandimento 10x, 20x e 40x
Disinfettante	QIKELONGAN	17-9185
Ago da dissezione	Bioroyee	17-9140
Nutriente per fiori	FANGJIE
Forcipe	HAIOU	4-94
Acido acetico glaciale	BOYUAN	676-2007
Glicerolo	Solarbio	G8190
Agitatore magnetico	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Agitatore orbitale	QILINBEIER	QB-206
Substrato di semina	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Vagliatura: 0-10 mm
Singolo vetrino concavo	HUABODEYI
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscopio	Leica	S8 APO	Ingrandimento da 1x a 4x
stagnola	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Pompa a vuoto	SHIDING	SHB-III
Misuratore di vortice	Silogex	MX-S

HBDY1895Carta