Denne protokol beskriver metoder til etablering af museendometrieepitelorganoider til genekspression og histologiske analyser.
Endometrievæv linjer livmoderens indre hulrum og er under cyklisk kontrol af østrogen og progesteron. Det er et væv, der består af luminalt og kirtelepitel, et stromalt rum, et vaskulært netværk og en kompleks immuncellepopulation. Musemodeller har været et kraftfuldt værktøj til at studere endometrium og afsløre kritiske mekanismer, der styrer implantation, placentation og kræft. Den seneste udvikling af 3D endometrieorganoidkulturer præsenterer en state-of-the-art model til at dissekere de signalveje, der ligger til grund for endometriebiologi. Etablering af endometrieorganoider fra genetisk manipulerede musemodeller, analyse af deres transkriptomer og visualisering af deres morfologi ved en enkeltcelleopløsning er afgørende værktøjer til undersøgelse af endometriesygdomme. Dette papir skitserer metoder til at etablere 3D-kulturer af endometrieepitel fra mus og beskriver teknikker til kvantificering af genekspression og analyse af organoidernes histologi. Målet er at tilvejebringe en ressource, der kan bruges til at etablere, dyrke og studere genekspression og morfologiske egenskaber ved endometrieepitelorganoider.
Endometrium – det indre slimhindevæv i livmoderhulen – er et unikt og meget dynamisk væv, der spiller kritiske roller i en kvindes reproduktive sundhed. I løbet af den reproduktive levetid har endometrium potentialet til at gennemgå hundredvis af cyklusser med spredning, differentiering og nedbrydning, koordineret af den samordnede virkning af ovariehormonerne – østrogen og progesteron. Undersøgelser af genetisk manipulerede mus har afdækket grundlæggende biologiske mekanismer, der understøtter endometrieresponset på hormoner og kontrol af embryoimplantation, stromalcelledecidualisering og graviditet1. In vitro-studier har imidlertid været begrænsede på grund af vanskeligheder med at opretholde ikke-transformeret primært museendometrievæv i traditionelle 2D-cellekulturer 2,3. Nylige fremskridt inden for kulturen af endometrievæv som 3D-organsystemer eller organoider giver en ny mulighed for at undersøge biologiske veje, der styrer endometriecellegenerering og differentiering. Mus og humane endometrieorganoidsystemer er blevet udviklet fra rent endometrieepitel indkapslet i forskellige matricer4,5, mens humant endometrium er blevet dyrket som stilladsfri epitel/stromale co-kulturer 6,7 og for nylig som kollagenindkapslede epitel-/stromale samlinger8 . Væksten og det regenerative potentiale af epitelorganoidkulturer understøttes af en defineret cocktail af vækstfaktorer og små molekylehæmmere, der er blevet empirisk bestemt til at maksimere vækst og regenerering af organoiderne 4,5,9. Desuden tillader evnen til at fryse og optø endometrieorganoider langsigtet bankning af endometrieorganoider fra mus og mennesker til fremtidige undersøgelser.
Gensplejsede mus har afsløret de komplekse signalveje, der styrer tidlig graviditet og decidualisering, og er blevet brugt som modeller for graviditetstab, endometriecancer og endometriose. Disse genetiske undersøgelser er stort set opnået med cellespecifik deletion af loxP-flankerede alleler (“floxed”) ved hjælp af cre-rekombinaser, der er specifikt aktive i kvindeligt reproduktionsvæv. Disse musemodeller omfatter den meget anvendte progesteronreceptor-cre 10, som har stærk rekombinaseaktivitet i endometrieepitel- og stromalvævet, lactoferrin i-cre, som inducerer endometrieepitelrekombination hos voksne mus11 eller Wnt7a-cre, som udløser epitelspecifik deletion i Müllerian-afledte væv12 . Dyrkning af endometrievæv fra genetisk manipulerede musemodeller som 3D-organoider har givet en glimrende mulighed for at undersøge endometriebiologi og lette identifikationen af vækstfaktorer og signalveje, der styrer endometriecellefornyelse og differentiering13,14. Metoder til isolering og dyrkning af museendometrievæv er beskrevet i litteraturen og rapporterer brugen af forskellige enzymatiske strategier til isolering af livmoderepitel til efterfølgende dyrkning af endometrieepitelorganoider4. Mens tidligere litteratur giver en kritisk ramme for endometrieepitelorganoidkulturprotokoller 4,5,6, giver dette papir en klar, omfattende metode til generering, vedligeholdelse, behandling og analyse af disse organoider. Standardisering af disse teknikker er vigtig for at fremskynde fremskridt inden for kvinders reproduktive biologi. Her rapporterer vi en detaljeret metode til enzymatisk og mekanisk oprensning af museendometrieepitelvæv til den efterfølgende kultur af endometrieorganoider i et gelmatrixstillads. Vi beskriver også metoderne til downstream histologiske og molekylære analyser af gelmatrix-indkapslede museendometrieepitelorganoider.
Her beskriver vi metoder til at generere endometrieepitelorganoider fra museendometrium og de protokoller, der rutinemæssigt anvendes til deres nedstrømsanalyse. Endometrieorganoider er et kraftfuldt værktøj til at studere de mekanismer, der styrer endometrierelaterede sygdomme, såsom endometriose, endometriecancer og implantationsfejl. Skelsættende undersøgelser offentliggjort i 2017 rapporterede betingelserne for dyrkning af langsigtede og vedvarende kulturer af endometrieorganoider fra mus og humant epitel<sup …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Stephanie Pangas og Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) for kritisk læsning og redigering af vores manuskript. Undersøgelser blev støttet af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development tilskud R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) og R01-HD110038 (M.M.M.) og af NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. har en Next Gen Pregnancy Award fra Burroughs Wellcome Fund.
Organoid Media Formulation | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
Other supplies and reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |