Stabilire organoidi endometriali 3D dall'utero del topo

Summary

Questo protocollo descrive le metodologie per stabilire organoidi epiteliali endometriali di topo per l’espressione genica e le analisi istologiche.

Abstract

Il tessuto endometriale riveste la cavità interna dell’utero ed è sotto il controllo ciclico di estrogeni e progesterone. È un tessuto composto da epitelio luminale e ghiandolare, un compartimento stromale, una rete vascolare e una popolazione di cellule immunitarie complesse. I modelli murini sono stati un potente strumento per studiare l’endometrio, rivelando meccanismi critici che controllano l’impianto, la placentazione e il cancro. Il recente sviluppo di colture organoidi endometriali 3D presenta un modello all’avanguardia per sezionare le vie di segnalazione che sono alla base della biologia endometriale. Stabilire organoidi endometriali da modelli murini geneticamente modificati, analizzare i loro trascrittomi e visualizzare la loro morfologia a una risoluzione a singola cellula sono strumenti cruciali per lo studio delle malattie dell’endometrio. Questo articolo delinea i metodi per stabilire colture 3D di epitelio endometriale da topi e descrive tecniche per quantificare l’espressione genica e analizzare l’istologia degli organoidi. L’obiettivo è quello di fornire una risorsa che possa essere utilizzata per stabilire, coltivare e studiare l’espressione genica e le caratteristiche morfologiche degli organoidi epiteliali endometriali.

Introduction

L’endometrio – il tessuto mucoso del rivestimento interno della cavità uterina – è un tessuto unico e altamente dinamico che svolge ruoli critici nella salute riproduttiva di una donna. Durante la vita riproduttiva, l’endometrio ha il potenziale per subire centinaia di cicli di proliferazione, differenziazione e rottura, coordinati dall’azione concertata degli ormoni ovarici – estrogeni e progesterone. Studi su topi geneticamente modificati hanno scoperto meccanismi biologici di base alla base della risposta endometriale agli ormoni e del controllo dell’impianto dell’embrione, della decidualizzazione delle cellule stromali e della gravidanza¹. Gli studi in vitro, tuttavia, sono stati limitati a causa delle difficoltà nel mantenere tessuti endometriali primari di topo non trasformati nelle colture cellulari 2D tradizionali ^2,3. I recenti progressi nella coltura dei tessuti endometriali come sistemi di organi 3D, o organoidi, rappresentano una nuova opportunità per studiare i percorsi biologici che controllano la rigenerazione e la differenziazione delle cellule endometriali. I sistemi organoidi endometriali di topo e umano sono stati sviluppati da epitelio endometriale puro incapsulato in varie matrici^4,5, mentre l’endometrio umano è stato coltivato come co-colture epiteliali/stromali prive di scaffold ^6,7 e, più recentemente^, come assembloidi epiteliali/stromali incapsulati in collagene⁸ . La crescita e il potenziale rigenerativo delle colture organoidi epiteliali è supportato da un cocktail definito di fattori di crescita e inibitori di piccole molecole che sono stati empiricamente determinati per massimizzare la crescita e la rigenerazione degli organoidi ^4,5,9. Inoltre, la capacità di congelare e scongelare gli organoidi endometriali consente la banca a lungo termine di organoidi endometriali da topi e umani per studi futuri.

Topi geneticamente modificati hanno rivelato le complesse vie di segnalazione che controllano la gravidanza precoce e la decidualizzazione e sono stati utilizzati come modelli di perdita di gravidanza, cancro dell’endometrio ed endometriosi. Questi studi genetici sono stati ampiamente raggiunti con la delezione cellulo-specifica di alleli affiancati da loxP (“floxed”) utilizzando cre ricombinasi che sono specificamente attive nei tessuti riproduttivi femminili. Questi modelli murini includono il recettore del progesterone-cre¹⁰, ampiamente utilizzato, che ha una forte attività ricombinasi nei tessuti epiteliali e stromali endometriali, la lattoferrina i-cre, che induce la ricombinazione epiteliale endometriale nei topi adulti¹¹, o Wnt7a-cre, che innesca la delezione epiteliale-specifica nei tessuti di derivazione mülleriana¹² . La coltura di tessuti endometriali da modelli murini geneticamente modificati come organoidi 3D ha fornito un’eccellente opportunità per studiare la biologia endometriale e facilitare l’identificazione dei fattori di crescita e delle vie di segnalazione che controllano il rinnovamento e la differenziazione delle cellule endometriali^13,14. I metodi per l’isolamento e la coltura del tessuto endometriale del topo sono descritti in letteratura e riportano l’uso di varie strategie enzimatiche per l’isolamento dell’epitelio uterino per la successiva coltura di organoidi epiteliali endometriali⁴. Mentre la letteratura precedente fornisce un quadro critico per i protocolli di coltura organoide epiteliale endometriale ^4,5,6, questo articolo fornisce un metodo chiaro e completo per generare, mantenere^, elaborare e analizzare questi organoidi. La standardizzazione di queste tecniche è importante per accelerare i progressi nel campo della biologia riproduttiva femminile. Qui, riportiamo una metodologia dettagliata per la purificazione enzimatica e meccanica del tessuto epiteliale endometriale di topo per la successiva coltura di organoidi endometriali in un’impalcatura a matrice di gel. Descriviamo anche le metodologie per le analisi istologiche e molecolari a valle degli organoidi epiteliali endometriali di topo incapsulati in gel con matrice di remu.

Protocol

La manipolazione dei topi e gli studi sperimentali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine e linee guida stabilite dalla Guida NIH per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. 1. Isolamento dell’epitelio uterino dai topi con metodi enzimatici e meccanici NOTA: Questa sezione descrive i passaggi necessari per stabilire, passare, congelare e scongelare …

Representative Results

Immagini a contrasto di fase di organoidi endometriali di topoAbbiamo stabilito organoidi dall’epitelio endometriale del topo WT, come descritto nel protocollo allegato (vedi diagramma in Figura 1). Dopo la dissociazione enzimatica dell’epitelio endometriale del topo, i fogli epiteliali sono stati separati meccanicamente dalle cellule stromali uterine e ulteriormente dissociati dalla collagenasi per generare una sospensione unicellulare. Se eseguito correttamente, questo…

Discussion

Qui, descriviamo i metodi per generare organoidi epiteliali endometriali dall’endometrio del topo e i protocolli utilizzati abitualmente per la loro analisi a valle. Gli organoidi endometriali sono un potente strumento per studiare i meccanismi che controllano le malattie correlate all’endometrio, come l’endometriosi, il cancro dell’endometrio e il fallimento dell’impianto. Studi di riferimento pubblicati nel 2017 hanno riportato le condizioni per la coltura a lungo termine e colture rinnovabili di organoidi endometriali…

Materials

Organoid Media Formulation
Name	Company	Catalog Number	Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free	Corning	354230	100%
Trypsin from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	T1426-1G	1%
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634010	1X
N2 supplement	Life Technologies	17502048	1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A	Life Technologies	12587010	1X
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165-5G	1.25 mM
L-glutamine	Life Technologies	25030024	2 mM
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636-100G	10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01	Tocris	2939	500 nM
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	50 ng/mL
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C	100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1	Peprotech	120-38	500 ng/mL
Recombinant human FGF-10	Peprotech	100-26	100 ng/mL
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	50 ng/mL
WNT3a	R&D systems	5036-WN	200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name	Company	Catalog Number	Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C0130-1G	5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	DN25-100MG	2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190-250	1X
HBSS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14170112	1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)	Fisher Scientific	#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)	Fisher Scientific	#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm	Fisher Scientific	#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)	Genesee Scientific	11-331
Trizol reagent	Invitrogen	15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	ThermoFisher	11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped	Sigma Aldrich	F6765-500ML	2%
Estratiol (E2)	Sigma Aldrich	E1024-1G	10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade	VWR	15710	4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes	Fisher Scientific	1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds	Fisher Scientific	64-010-15
Ethanol, 200 proof (100%)	Fisher Scientific	22-032-601
Histoclear	Fisher Scientific	50-899-90147
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags	Fisher Scientific	6774010
HistoGel Specimen Processing Gel	VWR	83009-992
Hematoxylin solution Premium	VWR	95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium	VWR	95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4	GenDEPORT	T8054	1X
TBST (10X), pH 7.4	GenDEPORT	T8056	1X
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	S4641-500G
Tween20	Fisher Scientific	BP337-500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-100G	3%
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher	62248	1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Labs	H-1000-10
Clear Nail Polish	Fisher Scientific	NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	22037246
VWR Micro Cover Glasses	VWR	48393-106
SuperScript VILO Master Mix	ThermoFisher	11755050
SYBR Green PCR Master Mix	ThermoFisher	4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)	DSHB	TROMA-I	1:50 dilution
Vimentin Antobody	Cell Signaling	5741S	1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-21209	1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21206	1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope	ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera	ZEISS
Primer Sequence	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')	_
Lipocalin 2 (Lcn2)	GCAGGTGGTACGTTGTGGG	CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)	TGAGGCCCTTGGACTCTGT	ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)	CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC	TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)	CAATGTGTCCGTCGTGGATCT	GCCTGCTTCACCACCTTCTT