Этот протокол описывает методологии установления эпителиальных органоидов эндометрия мышей для экспрессии генов и гистологического анализа.
Ткань эндометрия выстилает внутреннюю полость матки и находится под циклическим контролем эстрогена и прогестерона. Это ткань, которая состоит из просветного и железистого эпителия, стромального компартмента, сосудистой сети и сложной популяции иммунных клеток. Мышиные модели были мощным инструментом для изучения эндометрия, выявляя критические механизмы, которые контролируют имплантацию, плацентацию и рак. Недавняя разработка 3D-культур органоидов эндометрия представляет собой современную модель для анализа сигнальных путей, лежащих в основе биологии эндометрия. Создание органоидов эндометрия из генетически модифицированных моделей мышей, анализ их транскриптомов и визуализация их морфологии с одноклеточным разрешением являются важнейшими инструментами для изучения заболеваний эндометрия. В этой статье описываются методы создания 3D-культур эпителия эндометрия у мышей и описываются методы количественной оценки экспрессии генов и анализа гистологии органоидов. Цель состоит в том, чтобы предоставить ресурс, который может быть использован для установления, культивирования и изучения экспрессии генов и морфологических характеристик эпителиальных органоидов эндометрия.
Эндометрий – внутренняя слизистая оболочка полости матки – является уникальной и очень динамичной тканью, которая играет решающую роль в репродуктивном здоровье женщины. В течение репродуктивной жизни эндометрий обладает потенциалом для прохождения сотен циклов пролиферации, дифференцировки и распада, координируемых согласованным действием гормонов яичников – эстрогена и прогестерона. Исследования генетически модифицированных мышей выявили основные биологические механизмы, лежащие в основе реакции эндометрия на гормоны и контроля имплантации эмбриона, децидуализации стромальных клеток и беременности1. Исследования in vitro, однако, были ограничены из-за трудностей в поддержании нетрансформированных первичных тканей эндометрия мыши в традиционных 2D клеточных культурах 2,3. Последние достижения в культуре тканей эндометрия как 3D-систем органов или органоидов представляют собой новую возможность исследовать биологические пути, которые контролируют регенерацию и дифференцировку клеток эндометрия. Органоидные системы эндометрия мышей и человека были разработаны из чистого эпителия эндометрия, инкапсулированного в различные матрицы 4,5, в то время как эндометрий человека культивировался как эпителиальные/стромальные кокультуры без каркаса 6,7, а в последнее время как коллаген-инкапсулированные эпителиальные/стромальные ассамблоиды8 . Рост и регенеративный потенциал эпителиальных органоидных культур поддерживается определенным коктейлем факторов роста и ингибиторов малых молекул, которые были эмпирически определены для максимизации роста и регенерации органоидов 4,5,9. Кроме того, способность замораживать и размораживать органоиды эндометрия позволяет долгосрочно хранить органоиды эндометрия у мышей и людей для будущих исследований.
Генетически модифицированные мыши выявили сложные сигнальные пути, которые контролируют раннюю беременность и децидуализацию, и были использованы в качестве моделей потери беременности, рака эндометрия и эндометриоза. Эти генетические исследования были в значительной степени достигнуты с помощью клеточно-специфической делеции боковых аллелей loxP («floxed») с использованием cre recombinases, которые особенно активны в женских репродуктивных тканях. Эти мышиные модели включают широко используемый рецептор прогестерона-cre10, который обладает сильной активностью рекомбиназы в эпителиальных и стромальных тканях эндометрия, лактоферрин i-cre, который индуцирует рекомбинацию эпителия эндометрия у взрослых мышей11, или Wnt7a-cre, который вызывает эпителиально-специфическую делецию в тканях Мюллера12 . Культивирование тканей эндометрия из генетически модифицированных моделей мышей в качестве 3D-органоидов предоставило отличную возможность исследовать биологию эндометрия и облегчить идентификацию факторов роста и сигнальных путей, которые контролируют обновление и дифференцировку клеток эндометрия13,14. Методы выделения и культивирования тканей эндометрия мышей описаны в литературе и сообщают об использовании различных ферментативных стратегий выделения эпителия матки для последующего культивирования органоидов эпителия эндометрия4. В то время как предыдущая литература обеспечивает критическую основу для протоколов 4,5,6 эпителиальных органоидных культур эндометрия, эта статья предоставляет четкий, всеобъемлющий метод генерации, поддержания, обработки и анализа этих органоидов. Стандартизация этих методов имеет важное значение для ускорения прогресса в области репродуктивной биологии женщин. Здесь мы сообщаем подробную методику ферментативной и механической очистки эпителиальной ткани эндометрия мыши для последующей культивирования органоидов эндометрия в каркасе гелевой матрицы. Мы также описываем методологии последующего гистологического и молекулярного анализа инкапсулированных гелевой матрицей эпителиальных органоидов эндометрия мыши.
Здесь мы описываем методы генерации эпителиальных органоидов эндометрия из эндометрия мыши и протоколы, обычно используемые для их последующего анализа. Органоиды эндометрия являются мощным инструментом для изучения механизмов, которые контролируют заболевания, связанные с эндомет…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-ра Стефани Пангас и д-ра Мартина М. Мацука (M.M.M.) за критическое прочтение и редактирование нашей рукописи. Исследования были поддержаны грантами Национального института детского здоровья и развития человека Юнис Кеннеди Шрайвер R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) и R01-HD110038 (M.M.M.), а также грантом поддержки онкологического центра NCI-P30 (NCI-CA125123). Диана Монсивайс, доктор философии, имеет награду Next Gen Pregnancy Award от Burroughs Wellcome Fund.
Organoid Media Formulation | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
Other supplies and reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |