Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón
Summary
Este protocolo describe metodologías para establecer organoides epiteliales endometriales de ratón para la expresión génica y análisis histológicos.
Abstract
El tejido endometrial recubre la cavidad interna del útero y está bajo el control cíclico del estrógeno y la progesterona. Es un tejido que se compone de epitelio luminal y glandular, un compartimento estromal, una red vascular y una población compleja de células inmunes. Los modelos de ratón han sido una herramienta poderosa para estudiar el endometrio, revelando mecanismos críticos que controlan la implantación, la placentación y el cáncer. El reciente desarrollo de cultivos de organoides endometriales 3D presenta un modelo de vanguardia para diseccionar las vías de señalización que subyacen a la biología endometrial. Establecer organoides endometriales a partir de modelos de ratón genéticamente modificados, analizar sus transcriptomas y visualizar su morfología a una resolución de una sola célula son herramientas cruciales para el estudio de las enfermedades endometriales. Este documento describe métodos para establecer cultivos 3D de epitelio endometrial de ratones y describe técnicas para cuantificar la expresión génica y analizar la histología de los organoides. El objetivo es proporcionar un recurso que pueda usarse para establecer, cultivar y estudiar la expresión génica y las características morfológicas de los organoides epiteliales endometriales.
Introduction
El endometrio, el tejido mucoso del revestimiento interno de la cavidad uterina, es un tejido único y altamente dinámico que desempeña un papel crítico en la salud reproductiva de una mujer. Durante la vida reproductiva, el endometrio tiene el potencial de someterse a cientos de ciclos de proliferación, diferenciación y descomposición, coordinados por la acción concertada de las hormonas ováricas: estrógeno y progesterona. Los estudios de ratones genéticamente modificados han descubierto mecanismos biológicos básicos que sustentan la respuesta endometrial a las hormonas y el control de la implantación embrionaria, la decidualización de las células estromales y el embarazo1. Sin embargo, los estudios in vitro han sido limitados debido a las dificultades para mantener tejidos endometriales primarios de ratón no transformados en cultivos celulares 2D tradicionales 2,3. Los avances recientes en el cultivo de tejidos endometriales como sistemas de órganos 3D, u organoides, presentan una nueva oportunidad para investigar las vías biológicas que controlan la regeneración y diferenciación de las células endometriales. Los sistemas organoides endometriales de ratón y humano se han desarrollado a partir de epitelio endometrial puro encapsulado en varias matrices4,5, mientras que el endometrio humano se ha cultivado como cocultivos epiteliales/estromales sin andamios 6,7, y más recientemente como ensamblajes epiteliales/estromales encapsulados en colágeno8 . El crecimiento y el potencial regenerativo de los cultivos de organoides epiteliales están respaldados por un cóctel definido de factores de crecimiento e inhibidores de moléculas pequeñas que han sido determinados empíricamente para maximizar el crecimiento y la regeneración de los organoides 4,5,9. Además, la capacidad de congelar y descongelar organoides endometriales permite el almacenamiento a largo plazo de organoides endometriales de ratones y humanos para futuros estudios.
Los ratones genéticamente modificados han revelado las complejas vías de señalización que controlan el embarazo temprano y la decidualización, y se han utilizado como modelos de pérdida de embarazo, cáncer de endometrio y endometriosis. Estos estudios genéticos se han logrado en gran medida con la deleción celular específica de alelos flanqueados por loxP (“floxed”) utilizando recombinasas cre que son específicamente activas en los tejidos reproductivos femeninos. Estos modelos de ratón incluyen el ampliamente utilizado receptor de progesterona-cre 10, que tiene una fuerte actividad recombinasa en los tejidos epiteliales y estromales endometriales, lactoferrina i-cre, que induce la recombinación epitelial endometrial en ratones adultos11, o Wnt7a-cre, que desencadena la deleción epitelial específica en tejidos derivados de Müllerian12 . El cultivo de tejidos endometriales a partir de modelos de ratón genéticamente modificados como organoides 3D ha brindado una excelente oportunidad para investigar la biología endometrial y facilitar la identificación de factores de crecimiento y vías de señalización que controlan la renovación y diferenciación de las células endometriales13,14. Los métodos para el aislamiento y cultivo de tejido endometrial de ratón se describen en la literatura y reportan el uso de diversas estrategias enzimáticas para el aislamiento del epitelio uterino para el posterior cultivo de organoides epiteliales endometriales4. Si bien la literatura previa proporciona un marco crítico para los protocolos de cultivo de organoides epiteliales endometriales 4,5,6, este documento proporciona un método claro y completo para generar, mantener, procesar y analizar estos organoides. La estandarización de estas técnicas es importante para acelerar los avances en el campo de la biología reproductiva de la mujer. Aquí, presentamos una metodología detallada para la purificación enzimática y mecánica del tejido epitelial endometrial de ratón para el posterior cultivo de organoides endometriales en un andamio de matriz de gel. También describimos las metodologías para los análisis histológicos y moleculares posteriores de los organoides epiteliales endometriales de ratón encapsulados en matriz de gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos los métodos para generar organoides epiteliales endometriales a partir del endometrio del ratón y los protocolos utilizados rutinariamente para su análisis posterior. Los organoides endometriales son una herramienta poderosa para estudiar los mecanismos que controlan las enfermedades relacionadas con el endometrio, como la endometriosis, el cáncer de endometrio y el fracaso de la implantación. Estudios históricos publicados en 2017 reportaron las condiciones para cultivar cultivos a largo plazo y…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Dra. Stephanie Pangas y al Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) por la lectura crítica y edición de nuestro manuscrito. Los estudios fueron apoyados por las subvenciones del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) y R01-HD110038 (M.M.M.), y por la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico NCI-P30 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. tiene un Premio al Embarazo de la Próxima Generación del Burroughs Wellcome Fund.
Materials
| Organoid Media Formulation | |||
| Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
| Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
| ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
| Other supplies and reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
| Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
| Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
| Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
| Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
| TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
| Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
| VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
| Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
| Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
| ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
| Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
| Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
| Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT | |
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