Questo protocollo descrive le metodologie per stabilire organoidi epiteliali endometriali di topo per l'espressione genica e le analisi istologiche.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Stabilire organoidi endometriali 3D dall'utero del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tessuto endometriale riveste la cavità interna dell'utero ed è sotto il controllo ciclico di estrogeni e progesterone. È un tessuto composto da epitelio luminale e ghiandolare, un compartimento stromale, una rete vascolare e una popolazione di cellule immunitarie complesse. I modelli murini sono stati un potente strumento per studiare l'endometrio, rivelando meccanismi critici che controllano l'impianto, la placentazione e il cancro. Il recente sviluppo di colture organoidi endometriali 3D presenta un modello all'avanguardia per sezionare le vie di segnalazione che sono alla base della biologia endometriale. Stabilire organoidi endometriali da modelli murini geneticamente modificati, analizzare i loro trascrittomi e visualizzare la loro morfologia a una risoluzione a singola cellula sono strumenti cruciali per lo studio delle malattie dell'endometrio. Questo articolo delinea i metodi per stabilire colture 3D di epitelio endometriale da topi e descrive tecniche per quantificare l'espressione genica e analizzare l'istologia degli organoidi. L'obiettivo è quello di fornire una risorsa che possa essere utilizzata per stabilire, coltivare e studiare l'espressione genica e le caratteristiche morfologiche degli organoidi epiteliali endometriali.
Introduzione
L'endometrio - il tessuto mucoso del rivestimento interno della cavità uterina - è un tessuto unico e altamente dinamico che svolge ruoli critici nella salute riproduttiva di una donna. Durante la vita riproduttiva, l'endometrio ha il potenziale per subire centinaia di cicli di proliferazione, differenziazione e rottura, coordinati dall'azione concertata degli ormoni ovarici - estrogeni e progesterone. Studi su topi geneticamente modificati hanno scoperto meccanismi biologici di base alla base della risposta endometriale agli ormoni e del controllo dell'impianto dell'embrione, della decidualizzazione delle cellule stromali e della gravidanza1. ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
La manipolazione dei topi e gli studi sperimentali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine e linee guida stabilite dalla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Isolamento dell'epitelio uterino dai topi con metodi enzimatici e meccanici
NOTA: Questa sezione descrive i passaggi necessari per stabilire, passare, congelare e scongelare organoidi endometriali epiteliali da topi utilizzando un'impalcatura a matrice di gel. Studi precedenti hanno determinato che colture ottimali di orga....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Immagini a contrasto di fase di organoidi endometriali di topo
Abbiamo stabilito organoidi dall'epitelio endometriale del topo WT, come descritto nel protocollo allegato (vedi diagramma in Figura 1). Dopo la dissociazione enzimatica dell'epitelio endometriale del topo, i fogli epiteliali sono stati separati meccanicamente dalle cellule stromali uterine e ulteriormente dissociati dalla collagenasi per generare una sospensione unicellulare. Se eseguito correttamente, questo.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui, descriviamo i metodi per generare organoidi epiteliali endometriali dall'endometrio del topo e i protocolli utilizzati abitualmente per la loro analisi a valle. Gli organoidi endometriali sono un potente strumento per studiare i meccanismi che controllano le malattie correlate all'endometrio, come l'endometriosi, il cancro dell'endometrio e il fallimento dell'impianto. Studi di riferimento pubblicati nel 2017 hanno riportato le condizioni per la coltura a lungo termine e colture rinnovabili di organoidi endometriali.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Dott.ssa Stephanie Pangas e il Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) per la lettura critica e la redazione del nostro manoscritto. Gli studi sono stati sostenuti da Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development grants R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) e R01-HD110038 (M.M.M.), e da NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. ha ricevuto un Next Gen Pregnancy Award dal Burroughs Wellcome Fund.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Formulazione dei terreni organoidi | |||
| Name | Azienda | Numero catalogo | Concentrazione finale |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matrice della membrana basale, *Senza LDEV | Corning | 354230 | 100% |
| Tripsina dal pancreas bovino | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | |
| 1X N2 supplemento | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™ Integratore (50X), meno vitamina A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 &; g/mL |
| N-acetil-L-cisteina | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1,25 mM |
| L-glutammina | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
| ALK-4, -5, -7 inibitore, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| EGF umano ricombinante | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Noggin umana ricombinante | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| Rispondina-1 umana ricombinante | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| FGF-10 umana ricombinante | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| HGF umana ricombinante | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R& Sistemi D | 5036-WN | 200 ng/mL |
| Altre forniture e reagenti | |||
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Concentrazione finaleCollagenasi |
| da Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/ mL |
| Deossiribonucleasi I da pancreas bovino | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS, senza calcio, senza magnesio | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon Micropiastre in polistirene (24 pozzetti) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon Micropiastre in polistirene (12 pozzetti) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Filtri per celle di falco, 40 &; micro; m | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep (50 µ g) | Reagente Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM/F-12, HEPES, senza rosso fenolo | ThermoFisher | 11039021 | |
| Siero fetale bovino, Carbone spogliato | Sigma | Aldrich F6765-500ML | 2% |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| Formaldeide 16% in acquosa soluzione, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
| Epredia Cassette 1 Cassette per tessuti scanalate | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia Stampi per base per inclusione in acciaio inossidabile | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| Etanolo, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Mezzo di montaggio permanente | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia Nylon Sacche per biopsia | Fisher | Scientific 6774010 | |
| HistoGel Gel per l'elaborazione dei campioni | VWR | 83009-992 | |
| Soluzione di ematossilina Premium | VWR | 95057-844 | |
| Soluzione di eosina Y (giallastra) Premium | VWR | 95057-848 | |
| TBS Tampone, 20X, pH 7,4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X), pH 7,4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| Acido citrico. | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| Citrato di sodio tribasico diidrato | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | Diluizione 1:1000 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
| Smalto per unghie trasparente | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopio | Fisher Scientific | 22037246 | |
| VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| anticorpo Krt8 (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | Diluizione 1:50 |
| Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | Diluizione 1:200 |
| Anticorpo IgG anti-ratto d'asino (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-21209 | Diluizione 1:250 |
| Anti-Rabbin d'asino IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21206 | Diluizione 1:250 |
| ZEISS Stemi 508 Stereo Microscopio | ZEISS ZEISS | ||
| Axio Vert.A1 Microscopio di routine invertito con fotocamera digitale | ZEISS | ||
| Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| Lattoferrina (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
| Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATTTCCGG | |
| Gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi (Gapdh) | CAATGTGTGTGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
Riferimenti
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
- Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biol....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
