O-ring aortabånd versus traditionel tværgående aortaforsnævring til modellering af trykoverbelastningsinduceret hjertehypertrofi
Summary
Den nuværende protokol beskriver en ny teknik med aortabånd hos mus for at inducere trykoverbelastning hjertehypertrofi. Til banding anvendes en gummiring med en fast indvendig diameter. Denne nye teknik lover mindre varians og mere reproducerbare data til fremtidige eksperimenter.
Abstract
Aortabånd hos mus er en af de mest almindeligt anvendte eksperimentelle modeller til overbelastningsinduceret hjertehypertrofi og induktion af hjertesvigt. Den tidligere anvendte teknik er baseret på en gevindsutur omkring aortabuen bundet over en stump 27 G nål for at skabe stenose. Denne metode afhænger af, at kirurgen manuelt strammer tråden og dermed fører til høj varians i diameterstørrelsen. En nyligt raffineret metode beskrevet af Melleby et al. lover mindre varians og mere reproducerbarhed efter operationen. Den nye teknik, o-ring-aorta banding (ORAB), bruger en skridsikker gummiring i stedet for en sutur med en tråd, hvilket resulterer i reduceret variation i trykoverbelastning og reproducerbare fænotyper af hjertehypertrofi. Under operationen placeres o-ringen mellem brachiocephalic og venstre halspulsårer. Vellykket indsnævring bekræftes af ekkokardiografi. Efter 1 dag resulterer korrekt placering af ringen i en øget strømningshastighed i den tværgående aorta over den o-ringinducerede stenose. Efter 2 uger er nedsat hjertefunktion bevist ved nedsat udstødningsfraktion og øget vægtykkelse. Det er vigtigt, at ORAB ud over mindre varians i diameterstørrelsen er forbundet med lavere intra- og postoperativ dødelighed sammenlignet med tværgående aortaforsnævring (TAC). ORAB repræsenterer således en bedre metode end den almindeligt anvendte TAC-kirurgi, hvilket resulterer i mere reproducerbare resultater og en mulig reduktion i antallet af dyr, der er behov for.
Introduction
Mens fysiologisk hjertehypertrofi kan observeres under udvikling, motion og graviditet, reagerer patologisk hjertehypertrofi på hæmodynamiske stresstilstande som arteriel hypertension, hjerteklapsygdom eller genmutationer. I første omgang gennemgår hjertet en ombygning præget af øget kardiomyocytstørrelse og fortykkelse af ventrikulære vægge for at opretholde hjertefunktionen 1,2. På den anden side er patologisk hjerteombygning forbundet med en øget risiko for arytmi, pludselig død og høj dødelighed. Endelig resulterer det med tiden i ventrikulær dilatation, et stærkt fald i kontraktil funktion og eventuel progression til hjertesvigt (HF), som er forbundet med høj sygelighed, dødelighed og samfundsmæssige omkostninger3. Derfor er der et presserende behov for at forstå den molekylære baggrund for at udvikle nye terapeutiske strategier4.
Aorta banding er en model, der efterligner trykoverbelastningsinduceret venstre ventrikulær (LV) hypertrofi og hjertesvigt hos mus5. Med denne metode er det muligt at undersøge patomekanismerne for trykoverbelastningsinduceret hjerteombygning in vivo. Den første aortabåndsprocedure hos mus blev rapporteret af Rockman et al.6. Trykoverbelastning induceres af en trådsuturbaseret ligering omkring aorta (mellem brachiocephalic og venstre fælles halspulsåre). For at skabe en stenose med en diameter på 0,4 mm placeres en sutur omkring en 27 G nål og aorta. Efter ligering fjernes nålen 6,7.
Selvom nålediameteren er fast, er trådens tæthed meget afhængig af kirurgen og påvirker derfor den inducerede fænotype af hjertehypertrofi. Derudover er der i den tråd/suturbaserede metode en variabel grad af stenosediameter efter operationen, forbundet med en høj variation i dødeligheden 8,9. Desuden er træning af denne metode udfordrende, især med hensyn til at finde det rigtige niveau og konsistens i stramning af tråden. Endelig forekommer der i begyndelsen af træningen høj intra- og postoperativ dødelighed på grund af forstyrrelse af aorta eller anden vævsskade samt stor variation i omfanget af stenose hos de overlevende dyr.
For nylig blev en optimeret procedure for aortabånd beskrevet af Melleby et al.10. De præsenterede ORAB-metoden (o-ring aortabanding) med mindre varians i stenose og meget reproducerbare niveauer af trykoverbelastning ved hjælp af en skridsikker gummi-o-ring med en fast indvendig diameter på 0,71 mm, 0,66 mm og 0,61 mm. Kort sagt skæres o-ringen op, placeres omkring den stigende bue og lukkes igen med tråde. Andre forskere, der brugte disse o-ringe, rapporterede mindre variabilitet i den inducerede hjertehypertrofi9. De observerede også intra- og postoperativ dødelighed samt bedre reproducerbarhed og mindre varians i den inducerede hypertrofiske fænotype 9,11. Denne artikel beskriver proceduren for denne unikke strategi i en trinvis protokol. Den ekspertise, der deles i denne rapport, vil hjælpe andre forskere med at forbedre deres teknikker på dette område.
For at fremkalde hjertehypertrofi, der resulterer i hjertesvigt efter 6 uger, anbefales 12 uger gamle C57BL / 6N-hanmus til operation. En sammenligning 2 uger efter aortabånd mellem musestammerne C57BL/6N og C57BL/6J viste alvorlig hjertedysfunktion og tilhørende øget dødelighed hos C57BL/6N-mus. Derfor er disse bedre egnet til modeller af hjertesvigt12. Tolv uger gamle han- og hunmus har en optimal størrelse til eksponering af aorta og placering af o-ringen med specielle instrumenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tråd / suturbaseret aortabånd er blevet brugt i mange år til at inducere trykoverbelastning hjertehypertrofi hos mus. Det er en etableret metode til at undersøge patomekanismerne i hjerteombygning og sygdomsprogression in vivo. Begrænsningerne er den relativt høje varians i graden af stenose og dermed ombygningen. Den nyligt introducerede ORAB-teknik, der først blev beskrevet af Melleby et al.10 , optimerer den konventionelle metode ved hjælp af en gummi-o-ring.
<p class="jov…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) til L.L., N.F. og O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
Riferimenti
- Frey, N., Olson, E. N. Cardiac hypertrophy: The good, the bad, and the ugly. Annual Review of Physiology. 65, 45-79 (2003).
- Bui, A. L., Horwich, T. B., Fonarow, G. C. Epidemiology and risk profile of heart failure. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 30-41 (2011).
- Bolli, R. New initiatives to improve the rigor and reproducibility of articles published in Circulation Research. Circulation Research. 121 (5), 472-479 (2017).
- Dunlay, S. M., Weston, S. A., Jacobsen, S. J., Roger, V. L. Risk factors for heart failure: A population-based case-control study. The American Journal of Medicine. 122 (11), 1023-1028 (2009).
- Riehle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Circulation Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Hu, P., et al. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (3), 1261-1269 (2003).
- Mohammed, S. F., et al. Variable phenotype in murine transverse aortic constriction. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 188-198 (2012).
- Nakao, Y., et al. O-ring-induced transverse aortic constriction (OTAC) is a new simple method to develop cardiac hypertrophy and heart failure in mice. Scientific Reports. 12, 85 (2022).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Lindsey, M. L., Kassiri, Z., Virag, J. A. I., de Castro Bras, L. E., Scherrer-Crosbie, M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 733-752 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (38), e1729 (2010).
