Bendaggio aortico O-ring rispetto alla costrizione aortica trasversale tradizionale per modellare l'ipertrofia cardiaca indotta da sovraccarico pressorio
Summary
Il presente protocollo descrive una nuova tecnica di bendaggio aortico nei topi per indurre l’ipertrofia cardiaca da sovraccarico di pressione. Per le fascette, viene utilizzato un anello di gomma con un diametro interno fisso. Questa nuova tecnica promette meno varianza e dati più riproducibili per esperimenti futuri.
Abstract
Il banding aortico nei topi è uno dei modelli sperimentali più comunemente usati per l’ipertrofia cardiaca indotta da sovraccarico di pressione cardiaca e l’induzione dell’insufficienza cardiaca. La tecnica precedentemente utilizzata si basa su una sutura filettata attorno all’arco aortico legato su un ago smussato da 27 G per creare stenosi. Questo metodo dipende dal chirurgo che stringe manualmente il filo e, quindi, porta ad un’elevata varianza nella dimensione del diametro. Un metodo recentemente perfezionato descritto da Melleby et al. promette meno varianza e più riproducibilità dopo l’intervento chirurgico. La nuova tecnica, o-ring-aortic banding (ORAB), utilizza un anello di gomma antiscivolo invece di una sutura con un filo, con conseguente riduzione della variazione del sovraccarico di pressione e fenotipi riproducibili di ipertrofia cardiaca. Durante l’intervento chirurgico, l’o-ring viene posizionato tra le arterie brachiocefalica e carotide sinistra. La costrizione di successo è confermata dall’ecocardiografia. Dopo 1 giorno, il corretto posizionamento dell’anello determina un aumento della velocità del flusso nell’aorta trasversale sulla stenosi indotta dall’o-ring. Dopo 2 settimane, la funzione cardiaca compromessa è dimostrata dalla diminuzione della frazione di eiezione e dall’aumento dello spessore della parete. È importante sottolineare che, oltre a una minore varianza nella dimensione del diametro, l’ORAB è associato a tassi di mortalità intra e post-operatoria più bassi rispetto alla costrizione aortica trasversa (TAC). Pertanto, l’ORAB rappresenta un metodo superiore alla chirurgia TAC comunemente utilizzata, con risultati più riproducibili e una possibile riduzione del numero di animali necessari.
Introduction
Mentre l’ipertrofia cardiaca fisiologica può essere osservata durante lo sviluppo, l’esercizio fisico e la gravidanza, l’ipertrofia cardiaca patologica risponde a condizioni di stress emodinamico come ipertensione arteriosa, cardiopatia valvolare o mutazioni genetiche. Inizialmente, il cuore subisce un rimodellamento caratterizzato da aumento delle dimensioni dei cardiomiociti e ispessimento delle pareti ventricolari per mantenere la funzione cardiaca 1,2. D’altra parte, il rimodellamento cardiaco patologico è associato ad un aumentato rischio di aritmia, morte improvvisa e alta mortalità. Infine, con il tempo, si traduce in dilatazione ventricolare, una forte diminuzione della funzione contrattile e un’eventuale progressione verso l’insufficienza cardiaca (HF), che è associata ad alta morbilità, mortalità e costi sociali3. Pertanto, vi è un urgente bisogno di comprendere il background molecolare al fine di sviluppare nuove strategie terapeutiche4.
Il bendaggio aortico è un modello che imita l’ipertrofia ventricolare sinistra (LV) indotta da sovraccarico di pressione e l’insufficienza cardiaca nei topi5. Con questo metodo, è possibile esaminare in vivo i meccanismi patologici del rimodellamento cardiaco indotto da sovraccarico di pressione. La prima procedura di banding aortico nei topi è stata riportata da Rockman et al.6. Il sovraccarico di pressione è indotto da una legatura basata sulla sutura del filo intorno all’aorta (tra l’arteria carotide brachiocefalica e quella comune sinistra). Per creare una stenosi di 0,4 mm di diametro, una sutura viene posizionata attorno a un ago da 27 G e all’aorta. Dopo la legatura, l’ago viene rimosso 6,7.
Anche se il diametro dell’ago è fisso, la tenuta del filo dipende fortemente dal chirurgo e, quindi, influenza il fenotipo indotto dell’ipertrofia cardiaca. Inoltre, nel metodo basato su fili/suture, vi è un grado variabile di diametro stenosi dopo l’intervento chirurgico, associato ad un’elevata varianza nella mortalità 8,9. Inoltre, l’allenamento di questo metodo è impegnativo, soprattutto per quanto riguarda la ricerca del giusto livello e coerenza nel serraggio del filo. Infine, all’inizio dell’allenamento, si verifica un’elevata mortalità intra e post-operatoria dovuta all’interruzione dell’aorta o ad altre lesioni tissutali, nonché un’elevata variazione nell’entità della stenosi negli animali sopravvissuti.
Recentemente, una procedura ottimizzata di banding aortico è stata descritta da Melleby et al.10. Hanno presentato il metodo ORAB (o-ring aortic banding) con meno varianza nella stenosi e livelli altamente riproducibili di sovraccarico di pressione utilizzando un o-ring in gomma antiscivolo con un diametro interno fisso di 0,71 mm, 0,66 mm e 0,61 mm. In breve, l’o-ring viene aperto, posizionato attorno all’arco ascendente e richiuso da fili. Altri scienziati che hanno utilizzato questi o-ring hanno riportato una minore variabilità nell’ipertrofia cardiaca indotta9. Hanno anche osservato mortalità intra e post-operatoria, nonché una migliore riproducibilità e una minore varianza nel fenotipo ipertrofico indotto 9,11. Il presente articolo descrive la procedura di questa strategia unica in un protocollo passo-passo. L’esperienza condivisa in questo rapporto aiuterà altri scienziati a migliorare le loro tecniche in questo settore.
Per indurre ipertrofia cardiaca con conseguente insufficienza cardiaca dopo 6 settimane, i topi maschi C57BL / 6N di 12 settimane sono raccomandati per la chirurgia. Un confronto 2 settimane dopo il banding aortico tra i sottoceppi di topo C57BL/6N e C57BL/6J ha mostrato una grave disfunzione cardiaca e un aumento associato della mortalità nei topi C57BL/6N. Pertanto, questi sono più adatti per i modelli di insufficienza cardiaca12. I topi maschi e femmine di dodici settimane hanno una dimensione ottimale per l’esposizione dell’aorta e il posizionamento dell’o-ring con strumenti speciali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il bendaggio aortico basato su thread / sutura è stato utilizzato per molti anni per indurre ipertrofia cardiaca da sovraccarico di pressione nei topi. È un metodo consolidato per studiare i meccanismi patologici del rimodellamento cardiaco e della progressione della malattia in vivo. I limiti sono la varianza relativamente elevata nel grado di stenosi e, di conseguenza, il rimodellamento. La tecnica ORAB recentemente introdotta descritta per la prima volta da Melleby et al.10 ottimizz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) a L.L., N.F. e O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
Riferimenti
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