圧力過負荷誘発心肥大をモデル化するためのOリング大動脈バンディングと従来の横大動脈狭窄の比較
Summary
本プロトコールは、圧力過負荷心肥大を誘発するマウスにおける大動脈バンディングの新しい技術を記載する。バンディングには、内径が固定されたゴムリングが使用されます。この新しい手法は、将来の実験のために分散が少なく、再現性の高いデータを約束します。
Abstract
マウスの大動脈バンディングは、心圧過負荷誘発性心肥大および心不全の誘発に最も一般的に使用される実験モデルの1つです。以前に使用された技術は、狭窄を引き起こすために鈍い27Gの針の上に結ばれた大動脈弓の周りのねじ付き縫合糸に基づいています。この方法は、外科医が手動で糸を締めることに依存し、したがって、直径サイズの大きな変動をもたらす。Mellebyらによって記述された新しく洗練された方法は、手術後の変動が少なく、再現性が高いことを約束します。新しい技術であるOリング大動脈バンディング(ORAB)は、糸付きの縫合糸の代わりに滑り止めのゴムリングを使用しているため、圧力過負荷の変動が減少し、心肥大の再現可能な表現型が得られます。手術中、Oリングは腕頭動脈と左頸動脈の間に配置されます。成功した狭窄は心エコー検査によって確認されます。1日後、リングを正しく配置すると、Oリング誘発狭窄に対する横行大動脈の流速が増加します。2週間後、駆出率の低下と壁の厚さの増加によって心機能障害が証明されます。重要なことに、直径サイズのばらつきが少ないことに加えて、ORABは横行大動脈狭窄(TAC)と比較して術中および術後の死亡率が低いことに関連しています。したがって、ORABは、一般的に使用されているTAC手術よりも優れた方法であり、より再現性の高い結果をもたらし、必要な動物の数を減らすことができます。
Introduction
生理的心肥大は発達、運動、妊娠中に観察できますが、病的心肥大は動脈性高血圧、心臓弁膜症、遺伝子変異などの血行動態ストレス状態に反応します。最初に、心臓は、心筋細胞サイズの増加と心室壁の肥厚を特徴とするリモデリングを受け、心機能を維持します1,2。一方、病的心臓リモデリングは、不整脈、突然死、および高い死亡率のリスクの増加と関連しています。最後に、時間の経過とともに、心室拡張、収縮機能の大幅な低下、そして最終的には心不全(HF)への進行をもたらし、これは高い罹患率、死亡率、および社会的コストに関連しています3。したがって、新しい治療戦略を開発するためには、分子背景を理解することが急務である4。
大動脈バンディングは、マウス5において圧力過負荷誘発性左心室(LV)肥大および心不全を模倣するモデルである。この方法を用いることにより、生体内の圧力過負荷誘発心臓リモデリングの病態メカニズムを調べることができる。マウスにおける最初の大動脈バンディング手順は、Rockmanらによって報告された6。圧力過負荷は、大動脈の周り(腕頭動脈と左総頸動脈の間)の糸縫合ベースの結紮によって誘発されます。直径0.4 mmの狭窄を作成するには、27 Gの針と大動脈の周りに縫合糸を配置します。結紮後、針を取り外し6,7。
針の直径は固定されていますが、糸の締め付けは外科医に大きく依存しているため、誘発された心肥大の表現型に影響を与えます。さらに、糸/縫合ベースの方法では、手術後の狭窄直径の程度が変動し、死亡率の分散が大きい8,9。さらに、この方法のトレーニングは、特に糸を締める際の適切なレベルと一貫性を見つけることに関して、困難です。最後に、訓練の開始時に、大動脈の破壊または他の組織損傷による術中および術後の高い死亡率、ならびに生存動物における狭窄の程度における高い変動が起こる。
最近、大動脈バンディングの最適化された手順がMellebyらによって記述されました10。内径0.71mm、0.66mm、0.61mmに固定された滑り止めゴム製Oリングを用いて、狭窄のばらつきが少なく、圧力過負荷の再現性が高いORAB(Oリング大動脈バンディング)法を発表した。要するに、Oリングは切り開かれ、上行アーチの周りに置かれ、そして糸によって再び閉じられる。これらのOリングを使用している他の科学者は、誘発された心肥大の変動性が少ないと報告しました9。彼らはまた、術中および術後の死亡率、ならびに誘発された肥大表現型の再現性の向上と変動の減少を観察しました9,11。本稿では、この独自の戦略の手順を段階的なプロトコルで説明します。このレポートで共有されている専門知識は、他の科学者がこの分野での技術を向上させるのに役立ちます。
6週間後に心不全を引き起こす心肥大を誘発するために、12週齢のC57BL / 6N雄マウスが手術に推奨されます。マウス亜系統C57BL / 6NとC57BL / 6Jの間の大動脈バンディングの2週間後の比較は、C57BL / 6Nマウスで重度の心機能障害と関連する死亡率の増加を示しました。したがって、これらは心不全のモデルにより適しています12。12週齢のオスとメスのマウスは、大動脈の露出と特別な器具によるOリングの配置に最適なサイズを持っています。
Protocol
Representative Results
Discussion
糸/縫合ベースの大動脈バンディングは、マウスの圧力過負荷心肥大を誘発するために長年使用されてきました。生体内での心臓リモデリングや疾患進行の病態メカニズムを調べるための確立された方法です 。 制限は、狭窄の程度の比較的高い分散であり、その結果、リモデリングです。Mellebyらによって最初に記述された最近導入されたORAB技術は10 、ゴム製のOリン?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、ドイツ連邦共和国(BMBF)からL.L.、N.F.、O.J.M.(IVOLADMT-HF;FKZ 01KC2006A)。
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
Riferimenti
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