Skjuvbearbetning under hydrogelbildning resulterar i produktion av mikrogelsuspensioner som skjuvtunna men snabbt omstruktureras efter avlägsnande av skjuvkrafter. Sådana material har använts som en stödjande matris för bioprinting komplexa, cellbelastade strukturer. Här beskrivs metoder som används för att tillverka stödbädden och kompatibla biobläck.
Användningen av granulära matriser för att stödja delar under bioprintningsprocessen rapporterades först av Bhattacharjee et al. 2015, och sedan dess har flera metoder utvecklats för beredning och användning av stödjande gelbäddar i 3D-bioprinting. Detta dokument beskriver en process för att tillverka mikrogelsuspensioner med agaros (känd som flytande geler), där partikelbildning styrs av applicering av skjuvning under gelering. Sådan bearbetning producerar noggrant definierade mikrostrukturer, med efterföljande materialegenskaper som ger tydliga fördelar som inbäddningsmedia, både kemiskt och mekaniskt. Dessa inkluderar att bete sig som viskoelastiska fasta material vid nollskjuvning, vilket begränsar långdistansdiffusion och demonstrerar det karakteristiska skjuvningsförtunnande beteendet hos flockulerade system.
Vid avlägsnande av skjuvspänning har emellertid flytande geler kapacitet att snabbt återställa sina elastiska egenskaper. Denna brist på hysteres är direkt kopplad till de definierade mikrostrukturer som tidigare hänvisats till; På grund av bearbetningen underlättar reaktiva, icke-gelerade polymerkedjor vid partikelgränssnittet interpartikelinteraktioner – liknande en kardborreeffekt. Denna snabba återvinning av elastiska egenskaper möjliggör bioprinting av högupplösta delar från biomaterial med låg viskositet, eftersom snabb reformering av stödbädden fångar biobläcket på plats och bibehåller dess form. Dessutom är en fördel med agarosvätskegeler de asymmetriska gelnings- / smältövergångarna (geleringstemperatur på ~ 30 ° C och smälttemperatur på ~ 90 ° C). Denna termiska hysteres av agaros gör det möjligt att skriva ut och odla den bioprintade delen in situ utan att den stödjande vätskegelen smälter. Detta protokoll visar hur man tillverkar agarosvätskegeler och visar deras användning för att stödja produktionen av en rad komplexa hydrogeldelar inom suspenderad skiktadditiv tillverkning (SLAM).
Hydrogeler är perfekta material att använda som stöd för celltillväxt1. Beroende på vilket material som används gelar de via skonsamma mekanismer som inte äventyrar cellviabiliteten 2,3. Den höga vattenhalten (vanligtvis >90%) innebär att näringsämnen och syre lätt kan diffundera in i materialet och avfallsprodukter från cellmetabolism diffunderar ut4. Som sådan har cellviabilitet visat sig bevaras under perioder över 1 år5, och det finns nu exempel på hydrogeler som används för att lagra eller “pausa” celler för framtida terapeutisk användning6. De har använts i stor utsträckning inom vävnadsteknik för produktion av vävnadsliknande strukturer, men deras användning tenderar att begränsas av svårigheten att kontrollera både materialets struktur och sammansättning. Historiskt sett är hydrogelstyrkan relativt låg (i förhållande till många hårda vävnader) på grund av den höga vattenhalten och låga volymer som upptas av polymermatrisen som bildar strukturen. Dessutom erbjuder många vägar till gelering (termisk, jonotrop, fibrillogenes) ganska långsam kinetik, vilket innebär att deras mekaniska egenskaper tenderar att utvecklas stadigt med tiden. Med undantag för interpenetrerande nätverk resulterar låg mekanisk styvhet och långsamma härdningstider ofta i biobläck som inte kan stå fritt vid deponering, vilket tenderar att “sjunka” och förlora definitionen när de initialt extruderas.
I ett försök att övervinna denna nyckelfråga har inbäddade trycktekniker utvecklats som ger stöd under utskrift, medan konstruktionens mekaniska egenskaper utvecklar 7,8. När gelens mikrostruktur har utvecklats fullt ut och de mekaniska egenskaperna når ett optimalt kan stödmatrisen avlägsnas, vanligtvis genom försiktig tvättning eller smältning av stödfasen. Inledande arbete med detta tillvägagångssätt använde en viskös plurondispersion i vilken sekundärfasen fördelades9. På senare tid använde Bhattacharjee et al. geler i form av granulerad karbopol för att visa att matriser av celler kunde suspenderas i stödgelen10. Därefter rapporterade Hinton et al. om extrudering av gelbaserade material innehållande celler i en stödbädd som bestod av en mikrogelsuspension bildad av granulärt gelatin11. Efter extrudering av den cellinnehållande hydrogelen och dess efterföljande härdning avlägsnades gelatinet genom försiktig uppvärmning av stödbadet, vilket möjliggjorde smältning av gelatinet. Tyvärr har denna process fortfarande flera begränsningar. Till exempel är den kemiska strukturen hos gelatin i jämförelse med kollagen (följaktligen att det är en hydrolyserad form av kollagen) sådan att många kemiska delar över dess ryggrad kan interagera med biologiska enheter; Således kan en kvarvarande stödmatris störa nedströms biologiska processer. Dessutom utgör produkter av animaliskt ursprung en restriktiv användning när man ser till en tekniks översättbarhet. Detta skapar utmaningar om den tillverkade delen är avsedd att användas kliniskt, eller till och med om den ska användas för att svara på grundläggande biologiska frågor, där denna ytkontaminering kan orsaka ett betydande problem.
Vi har därefter skapat en förfinad process som möjliggör suspenderad tillverkning av hydrogeler, inom en stödjande matris, som inte har någon laddning under fysiologiska förhållanden och bildas av icke-animaliska material. Även om processen kan användas med en rad biopolymera stöd, ger agaros ett material som är inert mot biologiska interaktioner eftersom det är sockerbaserat och neutralt laddat vid fysiologiskt pH12,13. I stället för att fragmentera en redan existerande gel bildas stödmaterialet genom applicering av skjuvning under gelering14,15,16. Detta ger en matris av partiklar som uppvisar dendronliknande egenskaper vid ytan och dispergeras i en sekundär matris av ogelad polymer17,18. Resultatet är ett material med intressanta materialegenskaper 19,20,21,22 som kan skjuvtunna på liknande sätt som tidigare rapporterade granulära geler, men tenderar att återvinna viskositeten snabbare när skjuvningen avlägsnas 23. När det cellbärande materialet som extruderats in i stödmatrisen har mognat fullt ut kan stödmatrisen avlägsnas genom försiktig omrörning innan den placeras i odling. Det har visats att det är möjligt att använda denna process för att producera material med komplexa strukturer och rekapitulera de biologiska strukturerna i både huden och osteokondrala regionen23,24,25. Detta metodpapper beskriver i detalj hur man tillverkar stödmaterialet och belyser lämpliga biobläck som används inom en mängd komplexa strukturer.
Övervägande av valet av material som används för stödbädden
Under utvecklingsstadiet krävdes olika egenskaper av stödbädden. Dessa egenskaper innefattade: i) upprätthålla tillräcklig struktur för att suspendera det extruderade materialet; ii) skjuvningskapacitet så att skrivhuvudet kan röra sig fritt genom underlaget, iii) snabb omstrukturering (självläkande egenskaper), bildande stöd runt det deponerade biobläcket; iv) termiskt stabil vid både rumstemperatur och fysiologiska temperaturer; v) neutralt (dvs. oladdat) material som är relativt bioinert, över ett intervall av pH och elektrolyter (joniska arter och koncentrationer), vilket förhindrar interaktioner med celler och laddade biobläck; vi) giftfri, vii) helst från en källa utan djurförsök.
Även om det finns många biopolymermaterial som bibehåller flera av dessa inneboende egenskaper, med kapacitet att utföra suspenderad 3D-additiv tillverkning utan att överensstämma med alla dessa egenskaper 11,26,27, var avsikten här att producera en stödbädd som skulle övervinna vissa praktiska problem i samband med andra stödmaterial. På grund av de kemiska egenskaperna hos agaros och i synnerhet när den formulerades som en partikelformig vätskegel kunde alla dessa egenskaper erhållas. Detta möjliggjorde en stödbädd som kunde användas över en mängd olika biobläck23,24,25,28. Faktum är att materialets bioinerta natur gav möjlighet att bibehålla den tryckta strukturen in situ under hela kulturen, vilket möjliggjorde tillräckliga tidsramar för många olika biobläck att utvecklas fullt ut, utan förändringar i biologin. Dessutom möjliggjorde den partikelformiga, tunnare naturen enkel borttagning från den slutliga tryckta konstruktionen, medan det giftfria, icke-animaliska ursprunget möjliggör potential för snabb översättning till kliniken och övervinner hinder relaterade till etiska och regulatoriska krav.
Överväganden vid val av material för biobläck
Vid bioprinting med direktextrudering deponeras biobläck på en 2D-utskriftsbädd. Det är fördelaktigt att monomer biobläcklösningar har skjuvningsförtunnande beteende; För att producera hifi-konstruktioner med fysiologiskt relevanta dimensioner måste de emellertid ha låg tixotropi och återhämta sig till tillräckligt höga viskositeter så att de bildar fasta filament vid deponering 29,30,31. Med ökad viskositet är trycket som krävs för extrudering mycket högre, vilket ofta påverkar den inkapslade cellviabiliteten31,32 negativt. Suspensionsbioprinting tar bort denna begränsning, eftersom det extruderade materialet stöds av suspensionsbadet under tvärbindningen. Denna utveckling ökar enormt utbudet av biobläckformuleringar som kan användas. Till exempel har nyligen arbete visat användningen av kollagenlösningar med låg koncentration som skrivs ut i mycket komplexa geometrier analoga med hjärtans inre struktur33,34,35. I de applikationer som nämns i denna metod tillät inbäddad utskrift att biomaterialfärger valdes för att bäst replikera den fysiologiska miljön som de var avsedda för, istället för att deras förmåga skulle kunna skrivas ut.
Begränsningar i strukturstorlek
Genom hela biofabricationslitteraturen har det visats att olika typer av bioprinters, drivna av alternativa skrivhuvudtekniker, kan införlivas i inbyggda tillverkningstekniker. Den teknik som demonstreras här är inte annorlunda, med exempel som inkluderar en pneumatisk mikroextruderingsbaserad bioprinter (INKREDIBLE), som demonstrerats av Senior et al., och extruderingsbaserade bioprinters med kontrollerbara mikroventiler (3D Discovery)23. Även om detta gör tekniken tillgänglig för en rad användare som kanske redan äger en bioprinter, är begränsningar av strukturens uppnåeliga storlek i slutändan beroende av bioprinterspecifikationerna i fråga. Ursprungligen definieras huvudbegränsningen för generering av stora strukturer av storleken på tryckbädden, gränserna för X-, Y- och Z-banor och även storleken på kärlet i vilket den stödjande vätskegelen finns.
Begränsningar i upplösning
Vid tillverkning av invecklade strukturer i mikrometerstorlek är den resulterande upplösningen starkt beroende av skrivarens precision (kontroll över stegstorlek, extruderingsgrad), utskriftsmunstyckets innerdiameter och en rad justerbara programvaruparametrar, inklusive utskriftshastighet, utskriftstryck och flödeshastighet36. Dessutom verkar kontroll över droppstorleken vara avgörande för att underlätta genereringen av högupplösta strukturer, med de bästa resultaten observerade i extruderingsskrivare med en kontrollerbar mikroventil. I slutändan, när alla parametrar är optimerade, kan utskriftsupplösningar uppnås för att matcha, eller till och med vara mindre än, den inre diametern hos extruderingsmunstycken, med det avsatta filamentet i storleksordningen mikrometerskala37. Detta är dock beroende av optimering av alla tidigare nämnda utskriftsparametrar, och upplösningen kan begränsas avsevärt av tryckmekanismen och precisionen. Pneumatisk extrudering verkar till exempel inte tillåta samma utskriftsupplösning som extrudering med en kontrollerbar mikroventil. Det finns därför en potentiell kostnadskonsekvens för att uppnå maximal utskriftsupplösning, eftersom sådana system medför en avsevärt ökad kostnad för användaren.
Framtidsutsikter och potential
För närvarande finns det ett stort intresse kring användningen av suspenderade tillverkningsprocesser för att möjliggöra produktion av komplexa mjuka strukturer som innehåller inbäddade celler, och det kommer utan tvekan att ske betydande framsteg under de kommande åren. Kontinuerliga framsteg när det gäller att förbättra utskriftsupplösningen ges, även om det återstår att se hur nödvändigt detta kommer att vara, med tanke på att de flesta biologiska system kan omorganisera sig på molekylär nivå. Medan fokus för intresse i media är kring användningen av 3D-tryckta vävnader för att direkt ersätta mänskliga vävnader efter skada eller sjukdom, är alla robusta medicinska procedurer som möjliggörs av dessa processer några år borta38,39. Det är mer troligt att effekterna av dessa komplexa odlingssystem kommer att vara i screening av droger eller till och med användas som verktyg för att förbättra vår förståelse av biologiska processer38. I synnerhet kan utvecklingsbiologi vara till stor nytta här, där exakt kontroll över den speciella avsättningen av molekyler gör det möjligt för forskare att utforska multifaktoriella systems roll på vävnadsutvecklingsprocesser.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka EPSRC (EP/L016346/1), MRC och Doctoral Training Alliance Biosciences for Health för finansiering och stöd till detta arbete.
3D Discovery Bioprinter | RegenHU | BIOFACTORY | Microvalve extrusion bioprinter |
Agarose | Merck | 9012-36-6 | Material used to create fluid gel support baths |
Benchtop autoclave | Prestige Medical | B8L75814 | Classic |
Brilliant Blue G | Merck | 6104-58-1 | Dye used to stain structures |
Calcium Chloride Dihydrate | Merck | 10035-04-8 | Used to reticulate printed structures |
Dexamethasone | Merck | D4902-25MG | Used in adipogenic media |
DMEM | Merck | D6429 | Cell culture media |
Duran bottle | Merck | Z305219 | glass bottle |
EVOS XL Core Imaging System | EVOS™ | AMEX1000 | Brightfield microscope with phase contrast |
FBS | Fisher Scientific | 10500-064 | Cell culture media supplement |
Gellan gum | Special Ingredients | 5060341112638 | Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model |
HEPES buffer | Merck | H9897-10PAK | Buffer for cell culture media |
Indomethacin | Merck | I7378 | Used in adipogenic media |
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) | Merck | I7018-100MG | Used in adipogenic media |
Keratinocyte growth medium | Lonza | 00192060 | Used as media to culture keratinocytes |
Low Methoxy Pectin | CP Kelco | LM-5CS | Pectin used to make pectin/collagen blends |
Penicillin-streptomycin | Merck | P4333-100ML | Used to inhibit bacterial growth |
PureCol EZ Gel solution | Merck | 5074 | Collagen solution used to make alginate/collagen blends |
Sodium Alginate | Merck | 9005-38-3 | Alginate powder used to make alginate/collagen blends |
TrypLE select | Fisher Scientific | 12563011 | cell dissociation enzyme |
T75 Flasks | StarLab | CC7682-4175 | Used for culturing cells |