Evaluering af spindelsamlingens kontrolpunktintegritet i museoocytter
Summary
Fejl i kromosomadskillelse er et almindeligt træk ved oocytter. Derfor giver undersøgelse af spindelsamlingskontrolpunktet vigtige spor om de mekanismer, der er nødvendige for at producere sunde æg. Denne protokol beskriver tre komplementære assays til evaluering af spindelsamlingens kontrolpunktintegritet i museoocytter.
Abstract
Aneuploidi er den førende genetiske abnormitet, der forårsager tidlig abort og graviditetssvigt hos mennesker. De fleste fejl i kromosomadskillelse, der giver anledning til aneuploidi, forekommer under meiose i oocytter, men hvorfor oocytmeiose er fejlbehæftet, forstås stadig ikke fuldt ud. Under celledeling forhindrer celler fejl i kromosomadskillelse ved at aktivere spindelsamlingskontrolpunktet (SAC). Denne kontrolmekanisme er afhængig af detektering af kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) vedhæftede filer og sensing spænding genereret af spindelfibre. Når KT’er ikke er fastgjort, aktiveres SAC og forhindrer cellecyklusprogression. SAC aktiveres først af MPS1-kinase, som udløser rekruttering og dannelse af det mitotiske checkpointkompleks (MCC), der består af MAD1, MAD2, BUB3 og BUBR1. Derefter diffunderer MCC ind i cytoplasmaet og sekvestrerer CDC20, en anafasefremmende kompleks / cyclosom (APC / C) aktivator. Når KT’er bliver fastgjort til mikrotubuli, og kromosomer er justeret ved metafasepladen, dæmpes SAC, CDC20 frigives, og APC / C aktiveres, hvilket udløser nedbrydningen af Cyclin B og Securin og derved tillader anafasedebut. Sammenlignet med somatiske celler er SAC i oocytter ikke så effektiv, fordi celler kan gennemgå anafase på trods af at de har ubundne KT’er. At forstå, hvorfor SAC er mere tilladende, og hvis denne tilladelse er en af årsagerne til kromosomadskillelsesfejl i oocytter, skal stadig undersøges yderligere. Denne protokol beskriver de tre teknikker til omfattende evaluering af SAC-integritet i museoocytter. Disse teknikker omfatter anvendelse af nocodazol til depolymerisering af MT’er til evaluering af SAC-responsen, sporing af SAC-hæmning ved at følge kinetikken ved Securin-destruktion og evaluering af rekrutteringen af MAD2 til KT’er ved immunofluorescens. Sammen sonder disse teknikker de mekanismer, der er nødvendige for at producere sunde æg ved at give en komplet evaluering af SAC-integritet.
Introduction
Aneuploidi, der stammer fra fejl i kromosomadskillelse, er den førende årsag til tidlige aborter og er stærkt forbundet med fejl i meiose1. Meiose adskiller sig fra mitose, fordi den består af to runder af celledeling uden et mellemliggende DNA-replikationstrin. I meiose I adskilles homologe kromosomer, mens søsterkromatider forbliver sammen. I oocytter er dette trin udsat for fejl, hvilket fører til aneuploide ægproduktion2.
For at forhindre kromosomadskillelsesfejl aktiverer de fleste celletyper en overvågningsmekanisme, der sætter cellecyklussen på pause, kaldet spindelsamlingskontrolpunktet (SAC). Denne mekanisme registrerer kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) vedhæftede filer, og spændingen genereres, når kromosomer orienteres på en bipolær måde3. Ikke-tilknyttede kinetochores udløser et SAC-svar, der starter med rekrutteringen af MPS1, SAC’s masterregulator, til kinetochores 3,4. MPS1 initierer rekruttering af andre SAC-komponenter, der fungerer som en platform til dannelse af mitotisk checkpoint-kompleks (MCC). MCC, der består af MAD1, MAD2, BUB3 og BUBR1, diffunderer ind i cytoplasmaet og hæmmer APC / C-aktivering ved at sekvestrere dens aktivator CDC20. Når alle kinetochores er stabilt fastgjort til MT’er, og kromosomer er justeret ved metafasepladen, dæmpes SAC’en, og MCC adskilles og frigiver CDC20, hvilket tillader APC / C-aktivering. Aktiv APC / C nedbryder Securin og Cyclin B, to vigtige trin i udløsning af anafase debut 5,6. I somatiske celler er SAC streng, fordi den aktiveres af en enkelt ikke-vedhæftet kinetochore og er tilstrækkelig til at inducere cellecyklusarrest6. Under oocytmeiose er SAC imidlertid mere tilladende, og oocytter kan komme ind i anafase I med en eller flere ikke-tilknyttede kinetochores 6,7,8,9,10. At forstå, hvorfor SAC er mere eftergivende i oocytter, er et løbende fokusområde på området. Mekanismer, der forårsager defekter i SAC-aktivering eller SAC-hæmning, kan føre til fejl i kromosomadskillelse eller langvarig cellecyklusstop og celledød. Derfor er evaluering af de mekanismer, der opretholder SAC-integritet i oocytter, vigtig for at forstå processen med at danne sunde, euploide æg.
Denne protokol beskriver teknikker til omfattende evaluering af SAC-integriteten i museoocytmeiose ved at undersøge forskellige kritiske trin i kontrolpunktet. Først beskrives evalueringen af SAC-responsen efter inducering af SAC-aktivering. Denne aktivering opnås ved at generere ikke-vedhæftede kinetochores ved hjælp af nocodazol, et lægemiddel, der depolymeriserer MT’er11. For det andet beskrives en metode til overvågning af SAC-hæmning ved at spore dynamikken i Securin-nedbrydning under oocytmodning. Endelig anvendes et immunofluorescensbaseret assay til at måle rekrutteringen af MAD2, en af MCC-komponenterne, til kinetochores. Sammen vurderer disse assays omfattende SAC-integritet under oocytmeiotisk modning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spindelsamlingskontrolpunktet er en kritisk kontrolmekanisme under celledeling designet til at forhindre kromosomadskillelsesfejl. Det gør det muligt for cellen at have tid nok til at rette forkerte KT-MT-vedhæftede filer. Meiose i oocytter er en fejlbehæftet proces, hvor det meste af kromosomets fejladskillelse forekommer under meiose I, hvilket fører til generering af aneuploide æg, der er hovedårsagen til tidlige aborter og infertilitet hos mennesker 1,24</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering til dette projekt blev ydet af National Institutes of Health (R35GM136340 til KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
Riferimenti
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
