Utvärdering av spindelaggregatets kontrollpunktsintegritet i musoocyter
Summary
Fel i kromosomsegregering är en vanlig egenskap hos oocyter. Att studera spindelmonteringskontrollpunkten ger därför viktiga ledtrådar om de mekanismer som behövs för att producera friska ägg. Detta protokoll beskriver tre kompletterande analyser för att utvärdera spindelmonteringskontrollpunktsintegritet i musoocyter.
Abstract
Aneuploidi är den ledande genetiska avvikelsen som orsakar tidigt missfall och graviditetsfel hos människor. De flesta fel i kromosomsegregering som ger upphov till aneuploidi uppstår under meios i oocyter, men varför oocytmeios är felbenägen är fortfarande inte helt klarlagd. Under celldelning förhindrar celler fel i kromosomsegregering genom att aktivera spindelmonteringskontrollpunkten (SAC). Denna kontrollmekanism bygger på detektering av kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) fästen och avkänning av spänning genererad av spindelfibrer. När KT är oanslutna aktiveras SAC och förhindrar cellcykelprogression. SAC aktiveras först av MPS1-kinas, vilket utlöser rekrytering och bildning av det mitotiska kontrollpunktskomplexet (MCC), bestående av MAD1, MAD2, BUB3 och BUBR1. Därefter diffunderar MCC in i cytoplasman och sekvestrerar CDC20, en anafasfrämjande komplex / cyklosom (APC / C) aktivator. När KT fästs vid mikrotubuli och kromosomer är inriktade vid metafasplattan tystas SAC, CDC20 frigörs och APC / C aktiveras, vilket utlöser nedbrytningen av cyklin B och Securin, vilket möjliggör anafasstart. Jämfört med somatiska celler är SAC i oocyter inte lika effektivt eftersom celler kan genomgå anafas trots att de har obundna KT. Att förstå varför SAC är mer tillåtande och om denna tillåtlighet är en av orsakerna till kromosomsegregeringsfel i oocyter behöver fortfarande undersökas ytterligare. Detta protokoll beskriver de tre teknikerna för att omfattande utvärdera SAC-integritet i musoocyter. Dessa tekniker inkluderar användning av nokodazol för att depolymerisera MT för att utvärdera SAC-svaret, spåra SAC-tystnad genom att följa kinetiken för Securin-förstörelse och utvärdera rekryteringen av MAD2 till KT genom immunofluorescens. Tillsammans undersöker dessa tekniker mekanismer som behövs för att producera friska ägg genom att tillhandahålla en fullständig utvärdering av SAC-integriteten.
Introduction
Aneuploidi, som uppstår på grund av fel i kromosomsegregering, är den främsta orsaken till tidiga missfall och är starkt kopplad till misstag i meios1. Meios skiljer sig från mitos eftersom den består av två omgångar av celldelning utan ett mellanliggande DNA-replikationssteg. I meios I separeras homologa kromosomer medan systerkromatider förblir tillsammans. I oocyter är detta steg felbenäget, vilket leder till aneuploid äggproduktion2.
För att förhindra kromosomsegregeringsfel aktiverar de flesta celltyper en övervakningsmekanism som pausar cellcykeln, kallad spindelmonteringskontrollpunkt (SAC). Denna mekanism känner av kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) fästen och spänningen genereras när kromosomer är orienterade på ett bipolärt sätt3. Fria kinetokorer utlöser ett SAC-svar som börjar med rekryteringen av MPS1, SAC: s huvudregulator, till kinetokorer 3,4. MPS1 initierar rekryteringen av andra SAC-komponenter och fungerar som en plattform för att bilda det mitotiska kontrollpunktskomplexet (MCC). MCC, som består av MAD1, MAD2, BUB3 och BUBR1, diffunderar in i cytoplasman och hämmar APC / C-aktivering genom att sekvestrera dess aktivator CDC20. När alla kinetokorer är stabilt fästa vid MT och kromosomerna är inriktade vid metafasplattan, tystas SAC och MCC demonteras och frigör CDC20, vilket möjliggör APC / C-aktivering. Aktiv APC/C bryter ned Securin och cyklin B, två viktiga steg för att utlösa anafasdebut 5,6. I somatiska celler är SAC sträng eftersom den aktiveras av en enda obunden kinetochore och är tillräcklig för att inducera cellcykelstopp6. Under oocytmeios är dock SAC mer tillåtande och oocyter kan gå in i anafas I med en eller flera obundna kinetokorer 6,7,8,9,10. Att förstå varför SAC är mer tillåtande i oocyter är ett pågående fokusområde inom området. Mekanismer som orsakar defekter i SAC-aktivering eller SAC-tystnad kan leda till fel i kromosomsegregering eller långvarigt cellcykelstopp och celldöd. Därför är det viktigt att utvärdera mekanismerna som upprätthåller SAC-integriteten i oocyter för att förstå processen att bilda friska, euploida ägg.
Detta protokoll beskriver tekniker för att omfattande utvärdera SAC-integriteten i musoocytmeios genom att undersöka olika kritiska steg i kontrollpunkten. Först beskrivs utvärderingen av SAC-svaret efter inducering av SAC-aktivering. Denna aktivering uppnås genom att generera obundna kinetokorer med användning av nokodazol, ett läkemedel som depolymeriserar MTs11. För det andra beskrivs en metod för att övervaka SAC-ljuddämpning genom att spåra dynamiken i Securin-nedbrytning under äggmognad. Slutligen används en immunofluorescensbaserad analys för att mäta rekryteringen av MAD2, en av MCC-komponenterna, till kinetokorer. Tillsammans utvärderar dessa analyser SAC-integriteten under oocytens meiotiska mognad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spindelmonteringskontrollpunkten är en kritisk kontrollmekanism under celldelning utformad för att förhindra kromosomsegregeringsfel. Det gör att cellen får tillräckligt med tid för att korrigera felaktiga KT-MT-bilagor. Meios i oocyter är en felbenägen process, där det mesta av kromosomfelsegregeringen sker under meios I, vilket leder till generering av aneuploida ägg som är den främsta orsaken till tidiga missfall och infertilitet hos människor 1,24</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering för detta projekt tillhandahölls av National Institutes of Health (R35GM136340 till KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
Riferimenti
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
