Letaliteit Bioassay met behulp van Artemia salina L.
Summary
Dit werk is gericht op het evalueren en herzien van de Artemia salina letaliteit bioassay procedure, ook geïdentificeerd als pekel garnalen letaliteit ashality assay. Deze eenvoudige en goedkope methode geeft informatie over de algemene toxiciteit (beschouwd als een voorlopige toxiciteitsevaluatie) van monsters, namelijk natuurlijke producten.
Abstract
Natuurlijke producten worden al sinds de oudheid gebruikt om medicijnen te produceren. Tegenwoordig zijn er tal van chemotherapeutische geneesmiddelen verkregen uit natuurlijke bronnen en gebruikt tegen een overvloed aan ziekten. Helaas vertonen de meeste van deze verbindingen vaak systemische toxiciteit en bijwerkingen. Om de verdraagbaarheid van geselecteerde potentieel bioactieve monsters beter te evalueren, worden pekelgarnalen (Artemia salina) over het algemeen gebruikt als model in letaliteitsstudies. De A. salina-test is gebaseerd op het vermogen van de bestudeerde bioactieve stoffen om de microschaaldieren in hun larvale stadium (nauplii) te doden. Deze methode vormt een handig startpunt voor cytotoxiciteitsstudies, evenals voor de algemene toxiciteitsscreening van synthetische, semisynthetische en natuurlijke producten. Het kan worden beschouwd als een eenvoudige, snelle en goedkope test, vergeleken met veel andere assays (in vitro cellen of giststammen, zebravissen, knaagdieren) die over het algemeen geschikt zijn voor de bovengenoemde doeleinden; bovendien kan het gemakkelijk worden uitgevoerd, zelfs zonder specifieke training. Over het algemeen is de A. salina-test een nuttig hulpmiddel voor de voorlopige toxiciteitsevaluatie van geselecteerde verbindingen en de biogeleide fractionering van extracten van natuurlijke producten.
Introduction
Natuurlijke producten van planten, dieren of micro-organismen zijn in de loop der jaren een groeiend interessegebied geweest in de ontwikkeling van nieuwe bioactieve moleculen vanwege hun gevarieerde scala aan biologische en farmacologische activiteiten1. De bijbehorende bijwerkingen, medicijnresistentie of onvoldoende specificiteit van de middelen, vooral wanneer ze worden gebruikt als geneesmiddelen tegen kanker, vertegenwoordigen echter de belangrijkste factoren die kunnen leiden tot een ineffectieve behandeling 1,2.
In de afgelopen decennia zijn verschillende van planten afgeleide cytotoxische middelen ontdekt, waarvan sommige worden gebruikt als middelen tegen kanker 1,2,3. In deze context wordt paclitaxel gerapporteerd als een van de bekendste en meest actieve chemotherapeutische geneesmiddelen van natuurlijke oorsprong 3,4. Momenteel wordt geschat dat meer dan 35% van alle geneesmiddelen op de markt afkomstig is van of geïnspireerd is op natuurlijke producten5. De potentiële hoge toxiciteit van deze verbindingen vereist aandacht tijdens alle onderzoeksfasen, omdat verschillende soorten verontreinigingen of zelfs metabole componenten van de plant zelf toxische effecten kunnen veroorzaken. Daarom moeten in de voorbereidende fase farmacologische en toxicologische profielen worden uitgevoerd om de biologische activiteit en veiligheid van nieuwe potentiële plantaardige behandelingen te beoordelen. Om de toxiciteit van nieuwe bioactieve monsters te evalueren, kunnen ongewervelde dieren worden beschouwd als de beste modellen om te bestuderen. Ze eisen minimale ethische vereisten en staan voorlopige in vitro assays toe, om prioriteit te geven aan de meest veelbelovende producten voor de volgende testronde bij gewervelde dieren 1,6.
A. salina, algemeen bekend als pekelgarnalen, is een klein halofiel ongewervelde die behoort tot het geslacht Artemia (familie Artemiidae, orde Anostraca, subphylum Crustacea; Figuur 1). In mariene en aquatische zoute ecosystemen spelen pekelgarnalen een belangrijke voedingsrol omdat ze zich voeden met microalgen en bestanddelen zijn van het zoöplankton dat wordt gebruikt om vissen te voeden. Bovendien worden hun larven (bekend als nauplii) veel gebruikt bij de beoordeling van algemene toxiciteit tijdens voorbereidende studies 1,3,7.
Artemia spp. worden veel gebruikt in letaliteitsstudies en zijn ook een handig startpunt voor toxiciteitsbeoordelingen, door de toxiciteit van potentieel bioactieve stoffen te volgen op basis van hun vermogen om nauplii te doden die in het laboratorium zijn gekweekt 1,8. Om deze reden heeft het gebruik van A. salina aantrekkingskracht gewonnen in algemene toxiciteitsstudies, omdat het een zeer efficiënte en gebruiksvriendelijke methode is, in vergelijking met andere tests op diermodellen9.
Vanwege hun eenvoudige anatomie, kleine omvang en korte levenscyclus kan een groot aantal ongewervelde dieren in één experiment worden bestudeerd. Als zodanig combineren ze genetische aansprakelijkheid en goedkope compatibiliteit met grootschalige screenings1. In deze context toont het gebruik van pekelgarnalen in een algemene toxiciteitstest verschillende voordelen, zoals snelle groei (28-72 uur is nodig vanaf het uitkomen tot de eerste resultaten), kosteneffectiviteit en lange houdbaarheid van commerciële eieren, die het hele jaar door kunnen worden gebruikt 3,10. Aan de andere kant, omdat ongewervelde dieren een primitief orgaansysteem hebben en geen adaptief immuunsysteem hebben, vertegenwoordigen ze geen perfect en betrouwbaar model voor menselijke cellen1.
Het biedt echter een voorlopige evaluatiemethode voor de algemene toxiciteit van geselecteerde monsters. Omdat het veel wordt gebruikt als een letaliteitstest, kan het voorlopige aanwijzingen geven over de toxische effecten van potentiële middelen tegen kanker. Het wordt vaak ook gebruikt om feedback te krijgen over de algemene toxiciteit van verbindingen die zijn begiftigd met andere biologische activiteiten waarvoor het essentieel is om het laagst mogelijke sterftecijfer onder de Artemia-garnalen aan te tonen.
In een lopende studie van onze groep vertoonden verschillende extracten van Plectranthus-soorten antioxiderende en antimicrobiële activiteiten (ongepubliceerde resultaten). Tegelijkertijd werden geïsoleerde verbindingen verkregen door zuivering van de extracten en vervolgens chemisch gemodificeerd. De extracten, zuivere verbindingen en semisynthetische derivaten werden vervolgens getest in termen van algemene toxiciteit. In deze context beoogt dit werk een overzicht te geven van het gebruik van de Artemia letaliteitsbioassay voor de evaluatie van algemene toxiciteit en potentiële cytotoxische activiteit van bioactieve extracten en geïsoleerde verbindingen van verschillende planten van het geslacht Plectranthus11.
Figuur 1: Artemia salina onder de microscoop. Nieuw uitgekomen nauplii van A. salina zoals gezien onder de microscoop (vergroting 12x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de afgelopen jaren heeft de wetenschappelijke gemeenschap haar aandacht voor alternatieve modellen voor toxiciteitsscreenings vergroot21. Naast A. salina letaliteit bioassay, worden andere methoden meestal uitgevoerd voor de evaluatie van de verdraagbaarheid van monsters en omvatten gewervelde bioassays (zoals knaagdieren), ongewervelde dieren (zoals zebravissen), in vitro methoden met behulp van giststammen of cellen, en in silico-methoden 22,23,24,25<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ter nagedachtenis aan professor Amilcar Roberto.
Dit werk werd financieel ondersteund door Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) in het kader van de projecten UIDB/04567/2020 en UIDP/04567/2020 toegeschreven aan CBIOS en PhD-subsidie SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |
Riferimenti
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -. M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. Toxicity testing is evolving. Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
