Saggio biologico di letalità con Artemia salina L.
Summary
Questo lavoro mira a valutare e rivedere la procedura di saggio biologico di letalità dell’Artemia salina , identificata anche come saggio di letalità dei gamberetti di salamoia. Questo metodo semplice ed economico fornisce informazioni sulla tossicità generale (considerata come una valutazione preliminare della tossicità) dei campioni, vale a dire i prodotti naturali.
Abstract
I prodotti naturali sono stati utilizzati fin dall’antichità per produrre medicinali. Al giorno d’oggi, ci sono molti farmaci chemioterapici ottenuti da fonti naturali e utilizzati contro una pletora di malattie. Sfortunatamente, la maggior parte di questi composti spesso mostrano tossicità sistemica ed effetti avversi. Al fine di valutare meglio la tollerabilità di campioni selezionati potenzialmente bioattivi, il gambero salamoia (Artemia salina) viene generalmente utilizzato come modello negli studi di letalità. Il test di A. salina si basa sulla capacità dei composti bioattivi studiati di uccidere i microcrostacei nel loro stadio larvale (naupli). Questo metodo rappresenta un comodo punto di partenza per gli studi di citotossicità, nonché per lo screening della tossicità generale di prodotti sintetici, semisintetici e naturali. Può essere considerato un test semplice, rapido e a basso costo, rispetto a molti altri saggi (cellule in vitro o ceppi di lievito, zebrafish, roditori) generalmente adatti agli scopi sopra indicati; Inoltre, può essere facilmente eseguito anche senza alcuna formazione specifica. Nel complesso, il saggio di A. salina rappresenta uno strumento utile per la valutazione preliminare della tossicità di composti selezionati e il frazionamento bioguidato di estratti di prodotti naturali.
Introduction
I prodotti naturali di piante, animali o microrganismi sono stati una crescente area di interesse nel corso degli anni nello sviluppo di nuove molecole bioattive a causa della loro variegata gamma di attività biologiche e farmacologiche1. Tuttavia, gli effetti collaterali associati, la resistenza ai farmaci o l’inadeguata specificità degli agenti, specialmente se usati come farmaci antitumorali, rappresentano i principali fattori che possono portare a un trattamento inefficace 1,2.
Negli ultimi decenni sono stati scoperti diversi agenti citotossici di origine vegetale, alcuni dei quali utilizzati come agenti antitumorali 1,2,3. In questo contesto, il paclitaxel è segnalato come uno dei farmaci chemioterapici più noti e attivi di origine naturale 3,4. Attualmente, si stima che oltre il 35% di tutti i farmaci sul mercato derivino o siano ispirati a prodotti naturali5. La potenziale elevata tossicità di questi composti richiede considerazione durante tutte le fasi di studio, poiché diversi tipi di contaminanti o anche componenti metabolici della pianta stessa possono causare effetti tossici. Per questo motivo, i profili farmacologici e tossicologici dovrebbero essere intrapresi nella fase preliminare, per valutare l’attività biologica e la sicurezza di nuovi potenziali trattamenti a base vegetale. Per valutare la tossicità di nuovi campioni bioattivi, gli animali invertebrati possono essere considerati i migliori modelli da studiare. Richiedono requisiti etici minimi e consentono test preliminari in vitro, per dare priorità ai prodotti più promettenti per il prossimo ciclo di test sui vertebrati 1,6.
Comunemente noto come gambero salamoia, A. salina è un piccolo invertebrato alofilo appartenente al genere Artemia (famiglia Artemiidae, ordine Anostraca, subphylum Crustacea; Figura 1). Negli ecosistemi salini marini e acquatici, i gamberetti di salamoia svolgono un importante ruolo nutrizionale in quanto si nutrono di microalghe e sono costituenti dello zooplancton utilizzato per nutrire i pesci. Inoltre, le loro larve (note come naupli) sono ampiamente utilizzate nella valutazione della tossicità generale durante gli studi preliminari 1,3,7.
Le Artemia spp. sono ampiamente utilizzate negli studi di letalità e sono anche un comodo punto di partenza per le valutazioni di tossicità, monitorando la tossicità di composti potenzialmente bioattivi in base alla loro capacità di uccidere i naupli coltivati in laboratorio 1,8. Per questo motivo, l’uso di A. salina ha guadagnato attrazione negli studi di tossicità generale, perché è un metodo molto efficiente e facile da usare, rispetto ad altri test su modelli animali9.
Grazie alla loro anatomia semplice, alle piccole dimensioni e al breve ciclo di vita, un vasto numero di invertebrati può essere studiato in un singolo esperimento. In quanto tali, combinano l’amenabilità genetica e la compatibilità a basso costo con screening su larga scala1. In questo contesto, l’uso di gamberetti di salamoia in un saggio di tossicità generale mostra diversi vantaggi, come la crescita rapida (28-72 ore sono necessarie dalla schiusa ai primi risultati), l’economicità e la lunga durata di conservazione delle uova commerciali, che possono essere utilizzate tutto l’anno 3,10. D’altra parte, poiché gli invertebrati hanno un sistema di organi primitivo e mancano di un sistema immunitario adattativo, non rappresentano un modello perfetto e affidabile per le cellule umane1.
Tuttavia, fornisce un metodo di valutazione preliminare per la tossicità generale di campioni selezionati. Poiché è ampiamente usato come test di letalità, può fornire indicazioni provvisorie sugli effetti tossici di potenziali agenti antitumorali. Viene spesso utilizzato anche per ottenere feedback sulla tossicità generale di composti dotati di qualsiasi altra attività biologica per la quale è essenziale mostrare il più basso tasso di mortalità possibile tra i gamberetti di Artemia .
In uno studio in corso dal nostro gruppo, diversi estratti di specie Plectranthus hanno mostrato attività antiossidanti e antimicrobiche (risultati non pubblicati). Parallelamente, composti isolati sono stati ottenuti mediante purificazione degli estratti e sono stati poi modificati chimicamente. Gli estratti, i composti puri e i derivati semisintetici sono stati quindi testati in termini di tossicità generale. In questo contesto, il presente lavoro si propone di fornire una panoramica dell’uso del saggio biologico di letalità dell’Artemia per la valutazione della tossicità generale e della potenziale attività citotossica di estratti bioattivi e composti isolati da diverse piante del genere Plectranthus11.
Figura 1: Artemia salina al microscopio. Naupli appena schiusi di A. salina visti al microscopio (ingrandimento 12x). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi anni, la comunità scientifica ha aumentato la sua attenzione verso modelli alternativi per gli screening di tossicità21. Oltre al saggio biologico sulla letalità di A. salina, vengono solitamente eseguite altre metodologie per la valutazione della tollerabilità del campione e includono saggi biologici di vertebrati (come roditori), invertebrati (come il pesce zebra), metodi in vitro che utilizzano ceppi o cellule di lievito e metodi in silico <sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In memoria del professor Amilcar Roberto.
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portogallo) nell’ambito dei progetti UIDB/04567/2020 e UIDP/04567/2020 attribuiti a CBIOS e PhD grant SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |
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