Summary

Bioensayo de letalidad utilizando Artemia salina L.

Published: October 11, 2022
doi:

Summary

Este trabajo tiene como objetivo evaluar y revisar el procedimiento de bioensayo de letalidad de Artemia salina , también identificado como ensayo de letalidad de camarones en salmuera. Este método simple y barato proporciona información sobre la toxicidad general (considerada como una evaluación preliminar de la toxicidad) de las muestras, es decir, los productos naturales.

Abstract

Los productos naturales se han utilizado desde la antigüedad para producir medicamentos. Hoy en día, hay un montón de fármacos quimioterapéuticos obtenidos de fuentes naturales y utilizados contra una gran cantidad de enfermedades. Desafortunadamente, la mayoría de estos compuestos a menudo muestran toxicidad sistémica y efectos adversos. Con el fin de evaluar mejor la tolerabilidad de muestras potencialmente bioactivas seleccionadas, el camarón de salmuera (Artemia salina) se utiliza generalmente como modelo en estudios de letalidad. La prueba de A. salina se basa en la capacidad de los compuestos bioactivos estudiados para matar a los microcrustáceos en su etapa larvaria (nauplios). Este método representa un punto de partida conveniente para los estudios de citotoxicidad, así como para el cribado de toxicidad general de productos sintéticos, semisintéticos y naturales. Puede considerarse un ensayo simple, rápido y de bajo costo, en comparación con muchos otros ensayos (células in vitro o cepas de levadura, pez cebra, roedores) generalmente adecuados para los fines antes mencionados; Además, se puede realizar fácilmente incluso sin ningún entrenamiento específico. En general, el ensayo de A. salina representa una herramienta útil para la evaluación preliminar de la toxicidad de compuestos seleccionados y el fraccionamiento bioguiado de extractos de productos naturales.

Introduction

Los productos naturales de plantas, animales o microorganismos han sido un área de creciente interés a lo largo de los años en el desarrollo de nuevas moléculas bioactivas debido a su variada gama de actividades biológicas y farmacológicas1. Sin embargo, los efectos secundarios asociados, la resistencia a los medicamentos o la especificidad inadecuada de los agentes, especialmente cuando se usan como medicamentos contra el cáncer, representan los principales factores que pueden conducir a un tratamiento ineficaz 1,2.

En las últimas décadas, se han descubierto varios agentes citotóxicos derivados de plantas, algunos de ellos utilizados como agentes anticancerígenos 1,2,3. En este contexto, el paclitaxel es reportado como uno de los fármacos quimioterapéuticosde origen natural más conocidos y activos 3,4. Actualmente, se estima que más del 35% de todos los medicamentos en el mercado se derivan o están inspirados en productos naturales5. La alta toxicidad potencial de estos compuestos requiere consideración durante todas las fases de estudio, ya que diferentes tipos de contaminantes o incluso componentes metabólicos de la propia planta pueden causar efectos tóxicos. Por esta razón, los perfiles farmacológicos y toxicológicos deben realizarse en la fase preliminar, para evaluar la actividad biológica y la seguridad de nuevos tratamientos potenciales a base de plantas. Para evaluar la toxicidad de nuevas muestras bioactivas, los animales invertebrados pueden considerarse como los mejores modelos para estudiar. Exigen requisitos éticos mínimos y permiten ensayos preliminares in vitro, para priorizar los productos más prometedores para la próxima ronda de ensayos en vertebrados 1,6.

Comúnmente conocido como camarón de salmuera, A. salina es un pequeño invertebrado halófilo perteneciente al género Artemia (familia Artemiidae, orden Anostraca, subfilo Crustacea; Figura 1). En los ecosistemas salinos marinos y acuáticos, los camarones de salmuera desempeñan un papel nutricional importante, ya que se alimentan de microalgas y son constituyentes del zooplancton utilizado para alimentar a los peces. Además, sus larvas (conocidas como nauplios) son ampliamente utilizadas en la evaluación de la toxicidad general durante los estudios preliminares 1,3,7.

Artemia spp. son ampliamente utilizadas en estudios de letalidad y también son un punto de partida conveniente para las evaluaciones de toxicidad, al rastrear la toxicidad de compuestos potencialmente bioactivos en función de su capacidad para matar nauplios cultivados en el laboratorio 1,8. Por esta razón, el uso de A. salina ganó atracción en los estudios de toxicidad general, ya que es un método muy eficiente y fácil de usar, en comparación con otras pruebas en modelos animales9.

Debido a su anatomía simple, tamaño pequeño y ciclo de vida corto, se puede estudiar una gran cantidad de invertebrados en un solo experimento. Como tales, combinan la racionalidad genética y la compatibilidad de bajo costo con exámenes a gran escala1. En este contexto, el uso de camarones de salmuera en un ensayo de toxicidad general muestra varias ventajas, como el rápido crecimiento (se necesitan 28-72 h desde la eclosión hasta los primeros resultados), la rentabilidad y la larga vida útil de los huevos comerciales, que se pueden usar durante todo el año 3,10. Por otro lado, dado que los invertebrados tienen un sistema de órganos primitivo y carecen de un sistema inmune adaptativo, no representan un modelo perfecto y confiable para las células humanas1.

Sin embargo, proporciona un método de evaluación preliminar para la toxicidad general de las muestras seleccionadas. Dado que es ampliamente utilizado como un ensayo de letalidad, puede proporcionar indicaciones provisionales sobre los efectos tóxicos de los posibles agentes anticancerígenos. A menudo también se utiliza para obtener información sobre la toxicidad general de los compuestos dotados de cualquier otra actividad biológica para la cual es esencial mostrar la tasa de mortalidad más baja posible entre los camarones Artemia .

En un estudio en curso de nuestro grupo, diferentes extractos de especies de Plectranthus mostraron actividades antioxidantes y antimicrobianas (resultados no publicados). Paralelamente, se obtuvieron compuestos aislados mediante purificación de los extractos y luego se modificaron químicamente. Los extractos, compuestos puros y derivados semisintéticos se probaron en términos de toxicidad general. En este contexto, el presente trabajo tiene como objetivo dar una visión general del uso del bioensayo de letalidad de Artemia para la evaluación de la toxicidad general y la actividad citotóxica potencial de extractos bioactivos y compuestos aislados de diferentes plantas del género Plectranthus11.

Figure 1
Figura 1: Artemia salina bajo el microscopio. Nauplios recién nacidos de A. salina vistos bajo el microscopio (aumento 12x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Preparación del equipo Adquirir equipos de incubación disponibles comercialmente. Seleccione un lugar adecuado para instalar el equipo de eclosión (Figura 2A). Coloque el recipiente en forma de embudo en el soporte negro (incluido en el conjunto) y gire el embudo en una dirección adecuada para ver la marca de nivel y el grifo. Para hacer equipos de migración hechos a mano, corte la parte superior de dos botellas de plástico de 0,5 L (5,8 cm de di…

Representative Results

La toxicidad general de algunos productos naturales recientemente estudiados por nuestro grupo se evaluó a través del bioensayo de letalidad de camarones en salmuera. Cuatro extractos (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; y Pe- P. ecklonii) del género Plectranthus , conocidos por su actividad antioxidante (resultados no publicados), fueron probados. Adicionalmente, dos compuestos naturales (1 y 2) obtenidos de Plectranthus spp., y tres derivados …

Discussion

Durante los últimos años, la comunidad científica ha aumentado su atención hacia modelos alternativos para el cribado de toxicidad21. Además del bioensayo de letalidad de A. salina, generalmente se realizan otras metodologías para la evaluación de la tolerabilidad de la muestra e incluyen bioensayos de vertebrados (como roedores), invertebrados (como el pez cebra), métodos in vitro utilizando cepas o células de levadura, y métodos in silico 22…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

En memoria del profesor Amílcar Roberto.

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) bajo los proyectos UIDB/04567/2020 y UIDP/04567/2020 atribuidos a CBIOS y beca de doctorado SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific, Denmark 174899 Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish
Aluminium foil Albal Can be purchased in supermarket
Artemio Set JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany 61066000 Can be purchased in pet shops
Binocular microscope Ceti, Belgium  1700.0000 Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz
Bottles 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm
Brine shrimp cysts JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany 3090700 Can be purchased in pet shops
Brine shrimp salt JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany 3090600 Can be purchased in pet shops
Dimethyl sulfoxide (DMSO) VWR chemicals CAS: 67-68-5  99% purity
Discartable tips Diamond F171500 Volume range: 100 – 1000 µL
Eppendorf microtubes BRAND 7,80,546 Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY
Erlenmeyer flask VWR chemicals 4,47,109 volume: 100 mL
Glass beaker Normax 3.2111654N Volume: 1000 mL
Gloves Guantes Luna GLSP3
GraphPad Prism GraphPad Software, San Diego, CA, USA GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software
Home-made A. salina Grower  -  - Home made: two plastic bottles connected by a hose
Hot glue Parkside PHP500E3 230 V, 50 Hz, 25 W
Incubator Heidolph Instruments, Denmark   - One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006
Light Roblan SKYC3008FE14 LED light bulb
Micropipettes VWR chemicals 613-5265 Volume range: 100 – 1000 µL
Potassium dichromate (K2Cr2O7) VWR chemicals CAS: 7778-50-9  99% purity
Pump ProAir a50 JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany  - Included in the Artemio Set+1 kit
Rubber tube 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter
Stirring rod VWR chemicals 441-0147 Equation 1 6 mm, 250 mm
Termometer VWR chemicals 620-0821 0 – 100 °C

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Citazione di questo articolo
Santos Filipe, M., Isca, V. M. S., Ntungwe N., E., Princiotto, S., Díaz-Lanza, A. M., Rijo, P. Lethality Bioassay Using Artemia salina L.. J. Vis. Exp. (188), e64472, doi:10.3791/64472 (2022).

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