Dödlighet Bioassay med Artemia salina L.
Summary
Detta arbete syftar till att utvärdera och granska Artemia salina lethality bioassay procedure, även identifierad som saltlake räkor lethality assay. Denna enkla och billiga metod ger information om den allmänna toxiciteten (betraktas som en preliminär toxicitetsutvärdering) av prover, nämligen naturliga produkter.
Abstract
Naturprodukter har använts sedan antiken för att producera läkemedel. Numera finns det gott om kemoterapeutiska läkemedel som erhållits från naturliga källor och används mot en uppsjö av sjukdomar. Tyvärr, de flesta av dessa föreningar visar ofta systemisk toxicitet och negativa effekter. För att bättre kunna utvärdera toleransen hos utvalda potentiellt bioaktiva prover används vanligtvis saltlakeräkor (Artemia salina) som modell i dödlighetsstudier. A. salina-testet är baserat på förmågan hos de studerade bioaktiva föreningarna att döda mikrokräftdjuren i deras larvstadium (nauplii). Denna metod utgör en lämplig utgångspunkt för cytotoxicitetsstudier, liksom för allmän toxicitetsscreening av syntetiska, semisyntetiska och naturliga produkter. Det kan betraktas som en enkel, snabb och billig analys jämfört med många andra analyser (in vitro-celler eller jäststammar, zebrafisk, gnagare) som i allmänhet är lämpliga för ovannämnda ändamål; Dessutom kan det enkelt utföras även utan någon specifik träning. Sammantaget representerar A. salina-analys ett användbart verktyg för den preliminära toxicitetsutvärderingen av utvalda föreningar och den biostyrda fraktioneringen av naturliga produktextrakt.
Introduction
Naturliga produkter från växter, djur eller mikroorganismer har varit ett växande intresseområde genom åren för utvecklingen av nya bioaktiva molekyler på grund av deras varierande utbud av biologiska och farmakologiska aktiviteter1. De associerade biverkningarna, läkemedelsresistensen eller otillräcklig specificitet hos medlen, särskilt när de används som läkemedel mot cancer, representerar dock de viktigaste faktorerna som kan leda till ineffektiv behandling 1,2.
Under de senaste decennierna har flera vegetabiliska cytotoxiska medel upptäckts, några av dem används som cancerläkemedel 1,2,3. I detta sammanhang rapporteras paklitaxel som ett av de mest kända och mest aktiva kemoterapeutiska läkemedlen av naturligt ursprung 3,4. För närvarande uppskattas det att mer än 35% av alla läkemedel på marknaden härrör från eller är inspirerade av naturprodukter5. Den potentiella höga toxiciteten hos dessa föreningar kräver övervägande under alla studiefaser, eftersom olika typer av föroreningar eller till och med metaboliska komponenter i själva växten kan orsaka toxiska effekter. Av denna anledning bör farmakologiska och toxikologiska profiler göras i den preliminära fasen för att bedöma den biologiska aktiviteten och säkerheten hos nya potentiella växtbaserade behandlingar. För att utvärdera toxiciteten hos nya bioaktiva prover kan ryggradslösa djur betraktas som de bästa modellerna att studera. De kräver minimala etiska krav och tillåter preliminära in vitro-analyser för att prioritera de mest lovande produkterna för nästa testomgång på ryggradsdjur 1,6.
Vanligtvis känd som saltlake räkor, A. salina är ett litet halofilt ryggradslöst djur som tillhör släktet Artemia (familj Artemiidae, ordning Anostraca, subfylum Crustacea; Figur 1). I marina och akvatiska saltlösningsekosystem spelar saltlake räkor en viktig näringsmässig roll eftersom de livnär sig på mikroalger och är beståndsdelar i djurplankton som används för att mata fisk. Dessutom används deras larver (så kallade nauplii) i stor utsträckning vid bedömningen av allmän toxicitet under preliminära studier 1,3,7.
används ofta i dödlighetsstudier och är också en lämplig utgångspunkt för toxicitetsbedömningar genom att spåra toxiciteten hos potentiellt bioaktiva föreningar baserat på deras förmåga att döda nauplii som odlas i laboratoriet 1,8. Av denna anledning fick användningen av A. salina attraktion i allmänna toxicitetsstudier, eftersom det är en mycket effektiv och lättanvänd metod jämfört med andra tester på djurmodeller9.
På grund av deras enkla anatomi, lilla storlek och korta livscykel kan ett stort antal ryggradslösa djur studeras i ett enda experiment. Som sådan kombinerar de genetisk mottaglighet och lågkostnadskompatibilitet med storskaliga screeningar1. I detta sammanhang visar användningen av saltlake räkor i en allmän toxicitetsanalys flera fördelar, såsom snabb tillväxt (28-72 h behövs från kläckning till de första resultaten), kostnadseffektivitet och lång hållbarhet för kommersiella ägg, som kan användas året runt 3,10. Å andra sidan, eftersom ryggradslösa djur har ett primitivt organsystem och saknar ett adaptivt immunsystem, representerar de inte en perfekt och pålitlig modell för mänskliga celler1.
Det ger dock en preliminär utvärderingsmetod för den allmänna toxiciteten hos utvalda prover. Eftersom det används i stor utsträckning som en dödlighetsanalys kan det ge provisoriska indikationer om de toxiska effekterna av potentiella cancermedel. Det används ofta också för att få feedback om den allmänna toxiciteten hos föreningar som är utrustade med andra biologiska aktiviteter för vilka det är viktigt att visa lägsta möjliga dödlighet bland Artemia-räkorna .
I en pågående studie från vår grupp visade olika extrakt från Plectranthus-arter antioxidant och antimikrobiella aktiviteter (opublicerade resultat). Parallellt erhölls isolerade föreningar genom rening av extrakten och modifierades sedan kemiskt. Extrakten, rena föreningar och semisyntetiska derivat testades sedan med avseende på allmän toxicitet. I detta sammanhang syftar detta arbete till att ge en översikt över användningen av Artemia dödlighetsbioassay för utvärdering av allmän toxicitet och potentiell cytotoxisk aktivitet hos bioaktiva extrakt och isolerade föreningar från olika växter av släktet Plectranthus11.
Figur 1: Artemia salina under mikroskopet. Nykläckt nauplii av A. salina sett under mikroskopet (förstoring 12x). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under de senaste åren har forskarsamhället ökat sin uppmärksamhet mot alternativa modeller för toxicitetsundersökningar21. Förutom A. salina lethality bioassay utförs vanligtvis andra metoder för utvärdering av provtolerans och inkluderar ryggradsdjurs bioassays (såsom gnagare), ryggradslösa djur (såsom zebrafisk), in vitro-metoder med jäststammar eller celler och in silico-metoder 22,23,24,25<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Till minne av professor Amilcar Roberto.
Detta arbete fick ekonomiskt stöd av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) inom ramen för projekten UIDB/04567/2020 och UIDP/04567/2020 som tillskrivs CBIOS och doktorandbidrag SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |
Riferimenti
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -. M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. Toxicity testing is evolving. Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
