全層軟骨欠損ラットモデルの開発と評価
Summary
このプロトコルは、ラットの大腿滑車溝に穴を開け、その後の痛みの行動と組織病理学的変化を測定することにより、全層軟骨欠損(FTCD)モデルを確立します。
Abstract
外傷による膝関節の軟骨欠損は、クリニックで一般的なスポーツ関節損傷であり、これらの欠陥は関節痛、運動障害、そして最終的には変形性膝関節症(kOA)を引き起こします。しかし、軟骨欠損やkOAに対する効果的な治療法はほとんどありません。治療薬の開発には動物モデルが重要ですが、軟骨欠損の既存のモデルは不十分です。本研究では、ラットの大腿滑車溝に穴を開けて全層軟骨欠損(FTCD)モデルを確立し、その後の疼痛行動と病理組織学的変化を読み出し実験として使用した。手術後、機械的離脱閾値が低下し、損傷部位の軟骨細胞が失われ、マトリックスメタロプロテイナーゼMMP13発現が増加し、II型コラーゲン発現が減少し、ヒト軟骨欠損で観察された病理学的変化と一致しました。この方法論は簡単で簡単に実行でき、損傷直後の肉眼的観察を可能にします。さらに、このモデルは臨床的な軟骨欠損をうまく模倣することができ、軟骨欠損の病理学的過程を研究し、対応する治療薬を開発するためのプラットフォームを提供する。
Introduction
関節軟骨は、軟骨細胞と細胞外マトリックス1からなる高度に分化した高密度組織である。関節軟骨の表層は硝子軟骨の一種であり、表面が滑らかで、摩擦が少なく、強度と弾力性が高く、機械的ストレス耐性に優れています2。細胞外マトリックスはコラーゲンプロテオグリカンと水からなり、コラーゲン全体の約90%を占めるII型コラーゲンがコラーゲンの主成分です3。軟骨組織には血管や神経が存在しないため、損傷後の自己修復能力が不足しています4。したがって、外傷によって引き起こされる軟骨欠損は、診療所では常に難治性の関節疾患でした。さらに、この関節疾患は若者を襲う傾向があり、世界的な発生率は増加しています5,6。膝関節は軟骨欠損の最も一般的な部位であり、ここでの欠損は関節痛、関節機能障害、関節軟骨変性を伴い、最終的には変形性膝関節症(kOA)につながります7。膝関節の軟骨欠損は、患者に経済的および生理学的負担をもたらし、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼします8。この病気は、差し迫った解決策のない重大かつ緊急の臨床的課題をもたらします。現在、軟骨欠損の治療は手術が主力であるが、長期的な転帰は依然として満足のいくものではない9。
臨床的な軟骨欠損は最終的にkOAにつながるため、kOA動物モデルは軟骨欠損の病理学的研究や医薬品開発に一般的に使用されています。軟骨欠損修復の病態生理学的過程を理解するためには、軟骨の再生や線維軟骨と硝子軟骨の変化を観察するために、動物モデルの確立が重要です10。しかし、前十字靭帯離断(ACLT)、内側半月板の不安定化(DMM)、卵巣摘出術(OVX)、ハルスなどの一般的に使用されるkOA動物モデルは、通常、長期的なモデリングを必要とし、病理学的および疼痛の評価のみを可能にするため、医薬品開発の効率に限界があります11。手術モデルに加えて、モノヨードアセテート(MIA)やパパイン注射などの化学モデルも軟骨欠損を引き起こしますが、欠陥の程度はうまく管理できず、状態は臨床的現実からかけ離れています11。衝突は、より大きな動物の軟骨欠損をモデル化するための別のアプローチですが、この方法は特定の器具の使用に依存し、めったに適用されません12。
要約すると、既存のkOAモデルは、軟骨欠損の病因の研究や新薬の開発には理想的ではなく、軟骨欠損の特異的で標準化されたモデルが必要です。本研究では、ラットの大腿滑車溝に穴を開けることにより、全層軟骨欠損(FTCD)モデルを確立しました。モデル評価のために肉眼的観察、疼痛行動検査、および組織病理学的分析を行った。kOAの他の動物モデルとは異なり、このモデルはラットの全身状態にほとんど影響を与えません。このモデリングアプローチはアクセスしやすく、適切に管理でき、軟骨欠損からkOAへの進行の理解と効果的な治療法の開発をサポートします。このモデルは、変形性関節前関節の欠陥を治癒することによってkOAを予防する治療法の試験にも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、ラットの大腿滑車溝に穴を開けることによって臨床軟骨欠損を模倣するための動物モデルについて説明します(補足図1)。軟骨損傷後、末梢侵害受容器の興奮性または応答性が増強され、疼痛閾値の低下および刺激に対する応答性の増強をもたらし得る18。前臨床試験では、異なる種の動物における軟骨欠損のモデリングは常に痛みを?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、浙江省自然科学財団(助成金番号LQ20H270009)、中国自然科学財団(助成金番号82074464および82104890)、浙江省伝統中国医学財団(助成金番号2020ZA039、2020ZA096、および2022ZB137)、および浙江省衛生委員会の医療健康科学技術プロジェクト(助成金番号2016KYA196)の支援を受けました。
Materials
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
Riferimenti
- Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
- Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
- Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
- Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
- Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
- Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
- Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
- Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
- Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
- Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
- Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
- Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
- Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
- Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
- Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
- Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
- Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
- Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
- Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
- Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
- Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
- Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).
