多形性膠芽腫の並進同所性モデル
Summary
ここでは、遺伝子操作されたモデルマウス腫瘍に由来する細胞の頭蓋内注射によって樹立されたGBMの前臨床同所性マウスモデルについて述べる。このモデルは、ヒトGBMの疾患の特徴を示しています。トランスレーショナル研究のために、マウス脳腫瘍は in vivoMRI および組織病理学によって追跡される。
Abstract
ヒト多形性膠芽腫(GBM)の遺伝子改変マウス(GEM)モデルは、脳腫瘍の発生と進行を理解するために重要です。異種移植腫瘍とは異なり、GEMでは、腫瘍は免疫適格マウスの天然微小環境で発生します。しかし、前臨床治療研究におけるGBM GEMの使用は、腫瘍潜伏期間が長く、新生物頻度の不均一性、および進行性度の腫瘍発生のタイミングのために困難である。頭蓋内同所性注射 によって 誘導されたマウスは、前臨床試験にとってより扱いやすく、GEM腫瘍の特徴を保持しています。Rb、Kras、p53異常(TRP)を有するGEMモデルから派生した同所性脳腫瘍モデルを作成し、腫瘍細胞による線状壊死病巣を示すGBM腫瘍と、ヒトGBMに類似した高密度血管新生を発症した。GEM GBM腫瘍に由来する細胞は、野生型の系統が一致したレシピエントマウスに頭蓋内注射され、グレードIV腫瘍を再現するため、GEMマウスの長い腫瘍潜伏期間を回避し、前臨床試験用の大規模で再現性のあるコホートの作成を可能にします。GBMのTRP GEMモデルの高度に増殖性、浸潤性、および血管の特徴は、同所性腫瘍で再現され、組織病理学マーカーはヒトGBMサブグループを反映しています。腫瘍の成長は、連続MRIスキャンによって監視されます。免疫適格モデルにおける頭蓋内腫瘍の浸潤性のため、ここで概説した注射手順に注意深く従うことは、頭蓋外腫瘍の成長を防ぐために不可欠です。
Introduction
膠芽腫(GBM;グレードIV神経膠腫)は最も一般的で悪性の脳腫瘍であり、現在の治療法は効果がなく、生存期間の中央値は15か月です1。脳腫瘍の成長と病因に関与する複雑なシグナル伝達経路を表す信頼性の高い正確な前臨床モデルは、GBMの新しい治療レジメンの評価の進歩を促進するために不可欠です。ヒト脳腫瘍細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植したマウスモデルは、脳腫瘍の本来の免疫環境を反映しておらず、血液脳関門を通過する治療薬の能力を評価するためにも使用できません2。理想的には、前臨床マウスモデルはまた、周囲の実質3への高レベルの侵襲性を含むヒトGBM組織病理学を密接に再現すべきである。遺伝子改変マウス(GEM)モデルは、無傷の免疫系の状況で腫瘍を発症しますが、複雑な育種スキームが必要になることが多く、腫瘍はゆっくりと一貫性のない状態で発生する可能性があります4。GEM由来の同種移植片モデルは、担がんマウスの大規模なコホートがより短い時間枠で必要とされる前臨床治療研究に適しています。
以前の報告では、GEM腫瘍から直接誘導された同所性GBMマウスモデルについて説明しました。GEMにおける腫瘍形成は、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)を発現する細胞集団(主に星状細胞)における遺伝的事象によって開始され、その結果、GBMに進行する。これらのTRP GEMは、GFAP駆動Creリコンビナーゼへの曝露後にT121を発現するTgGZT121導入遺伝子(T)を保有しています。T121タンパク質発現は、Rb(Rb1、p107、およびp103)タンパク質活性の抑制をもたらす。GFAP駆動型Cre導入遺伝子(GFAP-CreERT2)の共発現は、タモキシフェンによる誘導後の成体星状細胞への発現を標的とする。TRPマウスはまた、Cre依存性変異Kras(KrasG12D;R)対立遺伝子は、受容体チロシンキナーゼ経路の活性化を表すため、Pten(P)5,6の喪失に対してヘテロ接合性である。受容体チロシンキナーゼ(RTK)、PI3K、およびRBネットワークにおける同時遺伝子異常は、GBM病因の74%に関与しています7。したがって、ヒトGBMで変化した一次シグナル伝達経路は、TRPマウス、特にGTKの共有下流標的が活性化されるGBM腫瘍における操作された突然変異によって表されます5。
GEM由来の同系同所性モデルは、GBMの異常な経路を標的とするがん治療薬を評価するためのプラットフォームとして使用するために、浸潤性やサブタイプバイオマーカーの存在など、ヒト脳腫瘍の特徴を再現するモデルとして検証されました。TRP脳から採取した腫瘍から細胞を培養し、皮質に頭蓋内注射するための定位装置を用いて、系統適合マウスの脳に再移植した。この前臨床同所性マウスモデルは、細胞性が高く、浸潤性で、有糸分裂率が高く、ヒトGBMで観察されたように、腫瘍細胞による壊死の線状病巣と密な血管新生を示すGBM腫瘍を発症しました。腫瘍体積および成長は、 in vivo 磁気共鳴画像法(MRI)によって測定した。
本報告では、初代GBM細胞または細胞株を野生型マウス脳に頭蓋内注射するための最適な手法について、TRP腫瘍を例に説明する。同じプロトコルを、免疫無防備状態のマウスおよび他のGBM細胞株に適合させることができる。最適ではない細胞調製や注入部位での細胞漏出などの一般的な落とし穴を回避し、定位装置を正しく使用してモデルの再現性と信頼性を確保するための重要なヒントを提供します。翻訳目的で、生きた動物の脳腫瘍増殖のMRI検出、組織学的特性評価、および担癌マウスでの治療例によってモデルを検証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
前臨床モデルは、多形性神経膠芽腫における新しい治療標的および新規治療戦略の評価に不可欠である。GBMの遺伝子改変マウスモデルは、自生部位に腫瘍が発生するという利点がありますが、多くの場合、潜伏期間が長く、腫瘍の成長が予測できません13。GEMモデル腫瘍は4〜5か月の潜伏期を示し、イメージング、リクルートメント、および治療の理想的な時間枠は個々のマ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
優れた技術支援をしてくださったアラン・E・クラガ氏と、手術技術を洗練させてくれたミシェル・L・ガンプレヒトさんに感謝しています。病理分析のフィリップL.マーティン博士と、MRIスキャンのフレデリック国立研究所小動物画像プログラムのリリアイレバ氏とジョセフカレン博士に感謝します。
このプロジェクトは、契約番号HHSN261201500003Iに基づいて、国立衛生研究所の国立がん研究所からの連邦資金の全体または一部に資金提供されています。この出版物の内容は、必ずしも保健社会福祉省の見解や方針を反映しているわけではなく、商号、商品、または組織の言及は、米国政府による承認を意味するものでもありません。
Materials
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
Riferimenti
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G. Glioblastoma: defining tumor niches. Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. Mouse Models of Experimental Glioblastoma. Gliomas. , (2021).
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
