다형성 교모세포종의 번역 동소 모델
Summary
여기에서 우리는 유전자 조작 마우스 모델 종양에서 파생된 세포의 두개내 주입에 의해 확립된 GBM에 대한 전임상 동소 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 인간 GBM의 질병 특징을 표시합니다. 중개 연구를 위해 마우스 뇌종양은 생체 내 MRI 및 조직병리학에 의해 추적됩니다.
Abstract
인간 다형성 교모세포종(GBM)에 대한 유전자 조작 마우스(GEM) 모델은 뇌종양의 발달과 진행을 이해하는 데 중요합니다. 이종 이식 종양과는 달리, GEM에서 종양은 면역 적격 마우스의 천연 미세 환경에서 발생합니다. 그러나 전임상 치료 연구에서 GBM GEM을 사용하는 것은 긴 종양 잠복기, 신생물 빈도의 이질성 및 고급 등급 종양 발달 시기로 인해 어렵습니다. 두개내 동소 주사를 통해 유도된 마우스는 전임상 연구에서 더 다루기 쉽고 GEM 종양의 특징을 유지합니다. 우리는 Rb, Kras 및 p53 수차(TRP)가 있는 GEM 모델에서 파생된 동소 뇌종양 모델을 생성했으며, 이는 신생물 세포에 의한 괴사의 선형 초점과 인간 GBM과 유사한 조밀한 혈관화를 나타내는 GBM 종양을 발달시킵니다. GEM GBM 종양에서 유래한 세포를 야생형의 균주 일치 수용자 마우스에 두개내 주입하고 등급 IV 종양을 재현하므로 GEM 마우스에서 긴 종양 잠복기를 우회하고 전임상 연구를 위한 크고 재현 가능한 코호트를 생성할 수 있습니다. GBM에 대한 TRP GEM 모델의 고증식성, 침습성 및 혈관 특징은 동소 종양에서 요약되며 조직병리학 마커는 인간 GBM 하위 그룹을 반영합니다. 종양 성장은 일련의 MRI 스캔으로 모니터링됩니다. 면역 적격 모델에서 두개내 종양의 침습적 특성으로 인해 여기에 설명된 주사 절차를 주의 깊게 따르는 것이 두개외 종양 성장을 방지하는 데 필수적입니다.
Introduction
교모세포종(GBM; grade IV glioma)은 가장 흔하고 악성 뇌종양이며, 현재의 치료법은 효과가 없어 생존 중앙값이 15개월이다1. 뇌종양 성장 및 병인과 관련된 복잡한 신호 전달 경로를 나타내는 신뢰할 수 있고 정확한 전임상 모델은 GBM에 대한 새로운 치료 요법 평가의 진전을 촉진하는 데 필수적입니다. 인간 뇌종양 세포주를 면역저하 마우스에 피하로 이식한 마우스 모델은 뇌종양의 본래 면역 환경을 반영하지 않으며, 혈액뇌장벽을 통과하는 치료제의 능력을 평가하는 데 사용할 수 없다2. 이상적으로, 전임상 마우스 모델은 또한 주변 실질에 대한 높은 수준의 침습성을 포함하여 인간 GBM 조직병리학을 밀접하게 재현해야 한다3. 유전자 조작 마우스(GEM) 모델은 온전한 면역계의 맥락에서 종양을 발생시키지만, 복잡한 육종 계획이 필요한 경우가 많으며, 종양이 느리고 일관되지 않게 진행될 수 있다4. GEM 유래 동종이식 모델은 종양이 있는 마우스의 대규모 코호트가 더 짧은 기간에 필요한 전임상 치료 연구에 더 적합합니다.
이전 보고서에서 우리는 GEM 종양에서 직접 파생된 동소 GBM 마우스 모델을 설명했습니다. GEM의 종양 형성은 신경교 섬유소 산성 단백질(GFAP)을 발현하는 세포 집단(주로 성상교세포)의 유전적 사건에 의해 시작되어 GBM으로 진행됩니다. 이 TRP GEM은 GFAP 구동 Cre 재조합효소에 노출된 후 T121을 발현하는 TgGZT121 이식유전자(T)를 보유합니다. T121 단백질 발현은 Rb (Rb1, p107, 및 p103) 단백질 활성의 억제를 초래한다. GFAP-driven Cre 이식유전자(GFAP-CreERT2)의 공동 발현은 타목시펜으로 유도한 후 성인 성상교세포로의 발현을 표적으로 합니다. TRP 마우스는 또한 Cre-의존성 돌연변이 Kras(KrasG12D; R) 대립유전자는, 수용체 티로신 키나아제 경로의 활성화를 나타내며, Pten(P)5,6의 손실에 대해 이형접합성이다. 수용체 티로신 키나아제(RTK), PI3K 및 RB 네트워크의 동시 유전자 이상은 GBM 발병기전의 74%와 관련이 있습니다7. 따라서 인간 GBM에서 변경된 1차 신호전달 경로는 TRP 마우스, 특히 RTK의 공유 다운스트림 표적이 활성화된 GBM 종양에서 조작된 돌연변이로 표시됩니다5.
GEM 유래 syngeneic orthotopic 모델은 GBM에서 비정상적인 경로를 표적으로 하는 암 치료제를 평가하기 위한 플랫폼으로 사용하기 위해 침습성 및 아형 바이오마커의 존재를 포함하여 인간 뇌종양의 특징을 요약하는 모델로 검증되었습니다. 세포는 TRP 뇌에서 채취한 종양에서 배양되고 피질의 두개내 주입을 위한 정위 장비를 사용하여 균주 일치 마우스의 뇌에 다시 이식되었습니다. 이 전임상 동소 마우스 모델은 인간 GBM에서 관찰된 바와 같이 유사분열 속도가 높은 고도로 세포성, 침습성, 다형성성이고 종양 세포에 의한 괴사의 선형 병소 및 조밀한 혈관화를 나타내는 GBM 종양을 개발했습니다. 종양 부피 및 성장은 생체내 자기 공명 영상(MRI)에 의해 측정되었다.
이 보고서에서는 TRP 종양을 예로 들어 원발성 GBM 세포 또는 세포주를 야생형 마우스 뇌에 두개내 주입하는 최적의 기술을 설명합니다. 동일한 프로토콜이 면역저하 마우스 및 다른 GBM 세포주에 대해 적응될 수 있다. 최적이 아닌 세포 준비 또는 주입 부위에서의 세포 누출과 같은 일반적인 함정을 방지하고 정위 장비를 올바르게 사용하여 모델 재현성과 신뢰성을 보장하기 위한 중요한 팁이 제공됩니다. 번역 목적을 위해, 우리는 살아있는 동물의 뇌종양 성장에 대한 MRI 검출, 조직학적 특성화를 통해 모델을 검증하고 종양이 있는 마우스에서의 치료 예를 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전임상 모델은 GBM에서 새로운 치료 표적과 새로운 치료 전략을 평가하는 데 필수적입니다. GBM에 대한 유전자 조작 마우스 모델은 자가성 부위에서 종양이 발생할 수 있다는 이점이 있지만, 종종 긴 잠복기와 예측할 수 없는 종양 성장을 보인다13. GEM 모델 종양은 4-5개월의 잠복기를 나타내며 이미징, 모집 및 치료를 위한 이상적인 시간 창은 개별 마우스마다 다릅니다. 동소 모델?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
탁월한 기술 지원을 해주신 Alan E. Kulaga 씨와 수술 기술을 개선해 주신 Michelle L. Gumprecht 씨에게 감사드립니다. 병리학 분석을 위해 Dr. Philip L. Martin과 MRI 스캔을 위한 Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program의 Ms. Lilia Ileva와 Dr. Joseph Kalen에게 감사드립니다.
이 프로젝트는 계약 번호 HHSN261201500003I에 따라 국립 보건원 국립 암 연구소 (National Cancer Institute, National Institutes of Health)의 연방 기금으로 전체 또는 부분적으로 자금을 지원받았습니다. 이 간행물의 내용이 반드시 보건복지부의 견해나 정책을 반영하는 것은 아니며, 상호, 상용 제품 또는 조직에 대한 언급이 미국 정부의 보증을 의미하지는 않습니다.
Materials
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
Riferimenti
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