Translationelle ortopiske modeller af glioblastom multiforme

Summary

Her beskriver vi en præklinisk ortopisk musemodel for GBM, etableret ved intrakraniel injektion af celler afledt af genetisk manipulerede musemodeltumorer. Denne model viser sygdomskendetegnene for human GBM. Til translationelle undersøgelser spores musehjernetumoren ved in vivo MR og histopatologi.

Abstract

Gensplejsede mus (GEM) modeller for human glioblastoma multiforme (GBM) er afgørende for at forstå udviklingen og progressionen af hjernetumorer. I modsætning til xenografttumorer opstår tumorer i GEM’er i det oprindelige mikromiljø i en immunkompetent mus. Imidlertid er brugen af GBM GEM’er i prækliniske behandlingsstudier udfordrende på grund af lange tumorlatenstider, heterogenitet i neoplasmafrekvens og tidspunktet for avanceret tumorudvikling. Mus induceret via intrakraniel ortopisk injektion er mere håndterbare til prækliniske undersøgelser og bevarer træk ved GEM-tumorerne. Vi genererede en ortopisk hjernetumormodel afledt af en GEM-model med Rb-, Kras- og p53-aberrationer (TRP), som udvikler GBM-tumorer, der viser lineære foci af nekrose af neoplastiske celler og tæt vaskularisering analog med human GBM. Celler afledt af GEM GBM-tumorer injiceres intrakranielt i vildtype, stammematchede modtagermus og reproducerer klasse IV-tumorer, hvilket omgår den lange tumorlatensperiode hos GEM-mus og muliggør oprettelse af store og reproducerbare kohorter til prækliniske undersøgelser. De meget proliferative, invasive og vaskulære træk ved TRP GEM-modellen for GBM rekapituleres i de ortotopiske tumorer, og histopatologiske markører afspejler humane GBM-undergrupper. Tumorvækst overvåges ved serielle MR-scanninger. På grund af den invasive karakter af de intrakranielle tumorer i immunkompetente modeller er det vigtigt at følge injektionsproceduren beskrevet her for at forhindre ekstrakraniel tumorvækst.

Introduction

Glioblastom (GBM; grad IV gliom) er den mest almindelige og ondartede hjernetumor, og nuværende behandlinger er ineffektive, hvilket resulterer i en median overlevelse på 15 måneder¹. Pålidelige og nøjagtige prækliniske modeller, der repræsenterer de komplekse signalveje, der er involveret i hjernetumorvækst og patogenese, er afgørende for at fremskynde fremskridtene med at evaluere nye terapeutiske regimer for GBM. Musemodeller, hvor humane hjernetumorcellelinjer implanteres subkutant i immunkompromitterede mus, afspejler ikke det oprindelige immunsystem i hjernetumorer, og de kan heller ikke bruges til at evaluere terapeutiske evne til at krydse blod-hjerne-barrieren². Ideelt set bør prækliniske musemodeller også nøje reproducere den humane GBM-histopatologi, herunder det høje niveau af invasivitet i det omgivende parenkym³. Selvom genetisk manipulerede mus (GEM) modeller udvikler tumorer i forbindelse med et intakt immunsystem, kræves der ofte komplicerede avlsordninger, og tumorer kan udvikle sig langsomt og inkonsekvent⁴. GEM-afledte allograftmodeller er bedre egnet til prækliniske terapeutiske studier, hvor store kohorter af tumorbærende mus er nødvendige inden for en kortere tidsramme.

I en tidligere rapport beskrev vi en ortopisk GBM-musemodel afledt direkte af GEM-tumorer. Tumorigenese i GEM initieres af genetiske begivenheder i cellepopulationer (primært astrocytter), der udtrykker glialfibrillært surt protein (GFAP), der resulterer i progression til GBM. Disse TRP GEMs har et TgGZT121 transgen (T), som udtrykker T121 efter eksponering for den GFAP-drevne Cre-rekombinase. T121-proteinekspression resulterer i undertrykkelse af Rb (Rb1, p107 og p103) proteinaktivitet. Co-ekspression af et GFAP-drevet Cre-transgen (GFAP-CreERT2) målretter ekspression til voksne astrocytter efter induktion med tamoxifen. TRP-mus har også en Cre-afhængig mutant Kras (Kras^G12D; R) allel, for at repræsentere aktivering af receptortyrosinkinasevejen og er heterozygote for tab af Pten (P)^5,6. Samtidige genaberrationer i receptortyrosinkinase (RTK), PI3K og RB-netværk er impliceret i 74% af GBM-patogenese⁷. Derfor er de primære signalveje, der er ændret i human GBM, repræsenteret af de konstruerede mutationer i TRP-mus, især GBM-tumorer, hvor delte nedstrømsmål for RTK’er aktiveres⁵.

Den GEM-afledte syngeneiske ortopiske model blev valideret som en model, der rekapitulerer træk ved humane hjernetumorer, herunder invasivitet og tilstedeværelsen af subtype biomarkører, til brug som en platform til evaluering af kræftterapi rettet mod afvigende veje i GBM. Celler blev dyrket fra tumorer høstet fra TRP-hjerner og genimplanteret i hjernen hos stammematchede mus ved hjælp af stereotaktisk udstyr til intrakraniel injektion i cortex. Denne prækliniske ortotopiske musemodel udviklede GBM-tumorer, der var meget cellulære, invasive, pleomorfe med en høj mitotisk hastighed og viste lineære foci af nekrose ved neoplastiske celler og tæt vaskularisering, som observeret for human GBM. Tumorvolumener og vækst blev målt ved in vivo magnetisk resonansbilleddannelse (MRI).

I denne rapport beskriver vi den optimale teknik til intrakraniel injektion af primære GBM-celler eller cellelinjer i vildtypemusehjernen ved hjælp af TRP-tumorer som et eksempel. Den samme protokol kan tilpasses til immunkompromitterede mus og andre GBM-cellelinjer. Der gives afgørende tips til at undgå almindelige faldgruber, såsom suboptimal celleforberedelse eller cellelækage på injektionsstedet, og til at bruge det stereotaktiske udstyr korrekt for at sikre modellens reproducerbarhed og pålidelighed. Til translationelle formål validerer vi modellen ved MR-påvisning af hjernetumorvækst hos levende dyr, histologisk karakterisering og præsenterer et eksempel på behandling i tumorbærende mus.

Protocol

Den her beskrevne undersøgelsesprotokol blev godkendt af NCI på Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick er akkrediteret af AAALAC International og følger Public Health Service Policy for pleje og brug af forsøgsdyr. Dyrepasning blev ydet i overensstemmelse med de procedurer, der er beskrevet i “Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.). 1. Klargøring af celler til injektion</p…

Representative Results

Mus, der injiceres med hjernetumorceller, bør overvåges dagligt for tegn på tumorvækst såsom anfald, ataksi, eller vægttab. Hjernetumorvækst kan også overvåges ved MR-scanning med jævne mellemrum. Ugentlige MR-scanninger muliggør visualisering af stigende tumorbyrde i hjernen og tumorvolumenmålinger (figur 1C). Især udviser TRP-tumorer aggressiv vækst, og 3D-tumorvolumener kan måles ved MR inden for 2 til 3 uger efter intrakraniel injektion (med et gennemsnitligt volumen på 3…

Discussion

Prækliniske modeller er afgørende for evalueringen af nye terapeutiske mål og nye behandlingsstrategier i GBM. Gensplejsede musemodeller for GBM har fordelen ved tumorforekomst på det autoktone sted, men ofte med lang latenstid og uforudsigelig tumorvækst¹³. GEM-modeltumorerne udviser en latenstid på 4-5 måneder, og det ideelle tidsvindue til billeddannelse, rekruttering og behandling varierer blandt individuelle mus. Den ortopiske model har en veletableret og medgørlig vækst- og behandli…

Materials

5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T