שיטת בידוד לתאי גזע המטופויטיים לטווח ארוך וקצר
Summary
אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד תאי גזע המטופויטיים ארוכי טווח (LT-HSCs) ותאי HSC לטווח קצר (ST-HSCs) באמצעות מערכת הדיווח Hoxb5.
Abstract
יכולת התחדשות עצמית ופוטנציאל התמיינות רב-שושלות נחשבים בדרך כלל למאפיינים המגדירים של תאי גזע המטופויטיים (HSC). עם זאת, מחקרים רבים הציעו כי הטרוגניות תפקודית קיימת בתא HSC. ניתוחים חד-תאיים שנערכו לאחרונה דיווחו על שיבוטים של HSC עם גורלות תאים שונים בתוך תא HSC, המכונים שיבוטים מוטים של HSC. המנגנונים העומדים בבסיס תוצאות הטרוגניות או שאינן ניתנות לשחזור מובנים מעט, במיוחד לגבי משך ההתחדשות העצמית כאשר שברי HSC מטוהרים מושתלים על ידי אימונוסטיין קונבנציונלי. לכן, קביעת שיטת בידוד ניתנת לשחזור עבור HSCs לטווח ארוך (LT-HSCs) ו- HSCs לטווח קצר (ST-HSCs), המוגדרת על ידי משך ההתחדשות העצמית שלהם, היא חיונית להתגברות על בעיה זו. באמצעות סינון רב-שלבי בלתי משוחד, זיהינו גורם שעתוק, Hoxb5, שעשוי להיות סמן בלעדי של LT-HSCs במערכת המטופויטית של עכבר. בהתבסס על ממצא זה, הקמנו קו עכברים של כתב Hoxb5 ובודדנו בהצלחה LT-HSCs ו-ST-HSCs. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד LT-HSCs ו- ST-HSCs באמצעות מערכת הכתב Hoxb5 . שיטת בידוד זו תסייע לחוקרים להבין טוב יותר את מנגנוני ההתחדשות העצמית ואת הבסיס הביולוגי להטרוגניות כזו בתא HSC.
Introduction
תאי גזע המטופויטיים (HSCs), בעלי יכולת התחדשות עצמית ורב-עוצמה, שוכנים בפסגת ההיררכיה ההמטופויטית 1,2. בשנת 1988 הדגימו וייסמן ועמיתיו לראשונה כי בידוד של HSCs עכבריים יכול להיות מושג באמצעות ציטומטריית זרימה3. לאחר מכן, דווח כי חלק שהוגדר על ידי שילוב של סמני פני התא, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, מכיל את כל HSCs בעכברים 4,5,6,7,8.
הוגדרו אימונופנוטיפית (שושלת−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSCs (להלן: pHSCs) נחשבו בעבר הומוגניים מבחינה תפקודית. עם זאת, ניתוחים חד-תאיים אחרונים גילו כי pHSCs עדיין מפגינים הטרוגניות ביחס ליכולת ההתחדשות העצמית שלהם 9,10 ורב-עוצמה11,12. באופן ספציפי, נראה כי שתי אוכלוסיות קיימות בחלק pHSC ביחס ליכולת ההתחדשות העצמית שלהם: תאי גזע המטופויטיים לטווח ארוך (LT-HSCs), שיש להם יכולת התחדשות עצמית מתמשכת, ותאי גזע המטופויטיים לטווח קצר (ST-HSCs), שיש להם יכולת התחדשות עצמית חולפת 9,10.
נכון להיום, המנגנונים המולקולריים של יכולת התחדשות עצמית המבדילים בין LT-HSCs ו-ST-HSCs עדיין אינם מובנים. חיוני לבודד את שתי אוכלוסיות התאים בהתבסס על יכולות ההתחדשות העצמית שלהן ולגלות את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיסן. מספר מערכות כתב הוכנסו גם לטיהור LT-HSCs13,14,15; עם זאת, טוהר LT-HSC המוגדר על ידי כל מערכת דיווח משתנה, וטיהור LT-HSC בלעדי לא הושג עד כה.
לכן, פיתוח מערכת בידוד עבור LT-HSCs ו-ST-HSCs יאיץ את המחקר בנוגע ליכולת התחדשות עצמית במקטע pHSC. בבידוד של LT-HSCs ו-ST-HSCs, מחקר שהשתמש בסינון רב-שלבי ובלתי מוטה זיהה גן יחיד, Hoxb5, המתבטא באופן הטרוגני בחלק pHSC16. בנוסף, ניתוח מח עצם של עכברי כתב Hoxb5 גילה כי כ 20%-25% של מקטע pHSC מורכב מתאיקופה Hoxb5. בדיקת השתלות תחרותית באמצעות Hoxb5 pos pHSCs ו- Hoxb5 neg pHSCs גילתה כי רק ל- Hoxb5pos pHSCs יש יכולת התחדשות עצמית לטווח ארוך, בעוד ש- Hoxb5 neg pHSCs מאבדים את יכולת ההתחדשות העצמית שלהם תוך תקופה קצרה, מה שמצביע על כך ש- Hoxb5 מזהה LT-HSCs בשבר pHSC16.
כאן, אנו מדגימים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד LT-HSCs ו- ST-HSCs באמצעות מערכת הכתב Hoxb5 . בנוסף, אנו מציגים בדיקת השתלות תחרותית כדי להעריך את יכולת ההתחדשות העצמית של Hoxb5pos/neg pHSCs (איור 1). מערכת כתבים זו של Hoxb5 מאפשרת לנו לבודד באופן פרוספקטיבי LT-HSCs ו-ST-HSCs ותורמת להבנת המאפיינים הספציפיים של LT-HSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
באופן מסורתי, HSCs המוגדרים על ידי סמנים בפני השטח של התא הוכנו כדי לחקור את הפונקציות של HSCs, כגון יכולת התחדשות עצמית ורב-עוצמה 19,20,21. עם זאת, החלק האימונופנוטיפי המוגדר (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC מכיל ש?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים להירושי קיונארי על הטיפול בבעלי חיים ועל כך שסיפק עכברים מושתלים ב- RIKEN BDR, כמו גם היטומי אוגה, קאיוקו נגאסאקה ומסאקי מיהאשי לניהול מעבדה באוניברסיטת קובה. המחברים גם מעריכים מאוד את התמיכה המתמשכת בעבודה זו. מסאנורי מיאנישי נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מספרי מענק KAKENHI JP17K07407 ו- JP20H03268, קרן הזיכרון Mochida למחקר רפואי ופרמצבטי, קרן מדעי החיים של יפן, קרן המדע טקדה, קרן אסטלס לחקר הפרעות מטבוליות, ו- AMED-PRIME, AMED תחת מענק מספר JP18gm6110020. Taro Sakamaki נתמך על ידי מספרי המענק של JSPS KAKENHI JP21K20669 ו- JP22K16334 ונתמך על ידי תוכנית הליבה לליבה של JSPS ותוכנית עמיתי המחקר הצעירים של RIKEN. Katsuyuki Nishi נתמך על ידי JSPS מספר מענק KAKENHI JP18J13408.
Materials
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
Riferimenti
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
