Представлен пошаговый протокол выделения долгосрочных гемопоэтических стволовых клеток (ЛТ-ГСК) и кратковременных ГСК (СТ-ГСК) с использованием репортерной системы Hoxb5.
Способность к самообновлению и потенциал многолинейной дифференцировки обычно рассматриваются как определяющие характеристики гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Однако многочисленные исследования показали, что функциональная гетерогенность существует в компартменте ГСК. Недавние одноклеточные анализы сообщили о клонах ГСК с различными судьбами клеток в компартменте ГСК, которые называются смещенными клонами ГСК. Механизмы, лежащие в основе гетерогенных или плохо воспроизводимых результатов, мало изучены, особенно в отношении продолжительности самообновления при трансплантации очищенных фракций ГСК обычным иммуноокрашиванием. Таким образом, создание воспроизводимого метода изоляции для долгосрочных ГСК (ЛТ-ГСК) и краткосрочных ГСК (СТ-ГСК), определяемых продолжительностью их самообновления, имеет решающее значение для преодоления этой проблемы. Используя непредвзятый многоступенчатый скрининг, мы идентифицировали фактор транскрипции Hoxb5, который может быть эксклюзивным маркером LT-HSC в кроветворной системе мыши. Основываясь на этом выводе, мы создали линию репортерных мышей Hoxb5 и успешно изолировали LT-HSC и ST-HSC. Здесь мы описываем подробный протокол выделения LT-HSC и ST-HSC с использованием репортерной системы Hoxb5 . Этот метод выделения поможет исследователям лучше понять механизмы самообновления и биологическую основу такой гетерогенности в компартменте ГСК.
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), обладающие способностью к самообновлению и мультипотентности, находятся на вершине гемопоэтической иерархии 1,2. В 1988 году Вайсман и его коллеги впервые продемонстрировали, что выделение ГСК мыши может быть достигнуто с помощью проточной цитометрии3. Впоследствии сообщалось, что фракция, определяемая комбинацией маркеров клеточной поверхности, Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34-/loFlk2–, содержит все ГСК у мышей 4,5,6,7,8.
Иммунофенотипически определенные (Lineage−c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 – / loFlk2-) ГСК (далее – pHSCs) ранее считались функционально однородными. Однако недавние одноклеточные анализы показали, что рГСК по-прежнему проявляют гетерогенность в отношении их способности к самообновлению9,10 и мультипотентности11,12. В частности, в фракции pHSC, по-видимому, существуют две популяции в отношении их способности к самообновлению: долгосрочные гемопоэтические стволовые клетки (LT-HSCs), которые обладают способностью к непрерывному самообновлению, и краткосрочные гемопоэтические стволовые клетки (ST-HSCs), которые обладают преходящей способностью к самообновлению 9,10.
На сегодняшний день молекулярные механизмы способности к самообновлению, которые отличают LT-ГСК и ST-ГСК, остаются малоизученными. Крайне важно изолировать обе клеточные популяции на основе их способности к самообновлению и обнаружить основные молекулярные механизмы. Также было внедрено несколько репортерных систем для очистки LT-HSC13,14,15; однако чистота LT-HSC, определяемая каждой репортерной системой, варьируется, и до настоящего времени не была достигнута исключительная очистка LT-HSC.
Таким образом, разработка системы изоляции для LT-HSC и ST-HSC ускорит исследования способности к самообновлению фракции pHSC. При выделении LT-ГСК и ST-ГСК исследование с использованием многоступенчатого несмещенного скрининга идентифицировало один ген Hoxb5, который гетерогенно экспрессируется в фракцииpHSC 16. Кроме того, анализ костного мозга мышей-репортеров Hoxb5 показал, что примерно 20-25% фракции pHSC состоит изpos-клеток Hoxb5. Конкурентный анализ трансплантации с использованием Hoxb5 pos pHSC и Hoxb5 neg pHSCs показал, что только Hoxb5pos pHSC обладают способностью к длительному самообновлению, в то время как Hoxb5neg pHSC теряют свою способность к самообновлению в течение короткого периода времени, что указывает на то, что Hoxb5 идентифицирует LT-HSC во фракцииpHSC 16.
Здесь мы демонстрируем пошаговый протокол для выделения LT-HSC и ST-HSC с использованием репортерной системы Hoxb5 . Кроме того, мы представляем конкурентный анализ трансплантации для оценки способности к самообновлению рГСК Hoxb5pos/neg (рис. 1). Эта репортерная система Hoxb5 позволяет нам проспективно изолировать LT-HSC и ST-HSC и способствует пониманию специфических для LT-HSC характеристик.
Традиционно для изучения функций ГСК, таких как способность к самообновлению и мультипотенция 19,20,21, были подготовлены ГСК, определяемые маркерами клеточной поверхности. Однако иммунофенотипически определенная (Lineage−c-Kit+S…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Хироши Киёнари за уход за животными и предоставление мышей-реципиентов в RIKEN BDR, а также Хитоми Ога, Каёко Нагасаку и Масаки Мияхаси за управление лабораторией в Университете Кобе. Авторы также высоко ценят постоянную поддержку этой работы. Масанори Мияниши был поддержан Японским обществом содействия науке (JSPS) KAKENHI с номерами грантов JP17K07407 и JP20H03268, Мемориальным фондом медицинских и фармацевтических исследований Мочида, Японским фондом наук о жизни, Научным фондом Такеда, Фондом исследований метаболических нарушений Астелласа и AMED-PRIME, AMED под номером гранта JP18gm6110020. Таро Сакамаки поддерживается JSPS KAKENHI с номерами грантов JP21K20669 и JP22K16334 и поддерживается Программа JSPS Core-to-Core и Программа младших научных сотрудников RIKEN. Кацуюки Ниши был поддержан грантом JSPS No KAKENHI JP18J13408.
0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
30G insulin syringe | BD | 326668 | |
40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
Lysis buffer | BD | 555899 | |
MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |