Isolasjonsmetode for langvarige og kortvarige hematopoietiske stamceller
Summary
Vi presenterer en trinnvis protokoll for isolering av langsiktige hematopoietiske stamceller (LT-HSC) og kortsiktige HSCs (ST-HSC) ved hjelp av Hoxb5 reportersystemet.
Abstract
Selvfornyelseskapasitet og multi-lineage differensieringspotensial anses generelt som de definerende egenskapene til hematopoietiske stamceller (HSC). Imidlertid har mange studier antydet at funksjonell heterogenitet eksisterer i HSC-rommet. Nylige enkeltcelleanalyser har rapportert HSC-kloner med forskjellige celleskjebner i HSC-rommet, som refereres til som partiske HSC-kloner. Mekanismene bak heterogene eller dårlig reproduserbare resultater er lite forstått, spesielt med hensyn til lengden på selvfornyelse når rensede HSC-fraksjoner transplanteres ved konvensjonell immunfarging. Derfor er etablering av en reproduserbar isolasjonsmetode for langsiktige HSC-er (LT-HSC) og kortsiktige HSC-er (ST-HSC), definert av lengden på selvfornyelsen, avgjørende for å overvinne dette problemet. Ved hjelp av objektiv flertrinnsscreening identifiserte vi en transkripsjonsfaktor, Hoxb5, som kan være en eksklusiv markør for LT-HSC i musens hematopoietiske system. Basert på dette funnet etablerte vi en Hoxb5 reportermuselinje og isolerte vellykket LT-HSCs og ST-HSCs. Her beskriver vi en detaljert protokoll for isolering av LT-HSC og ST-HSC ved bruk av Hoxb5 reportersystem. Denne isolasjonsmetoden vil hjelpe forskere bedre å forstå mekanismene for selvfornyelse og det biologiske grunnlaget for slik heterogenitet i HSC-rommet.
Introduction
Hematopoietiske stamceller (HSC), som har selvfornyelseskapasitet og multipotens, ligger på toppen av det hematopoietiske hierarkiet 1,2. I 1988 demonstrerte Weissman og kolleger for første gang at isolering av HSC hos mus kunne oppnås ved hjelp av flowcytometri3. Deretter ble en fraksjon definert ved en kombinasjon av celleoverflatemarkører, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, rapportert å inneholde alle HSCer hos mus 4,5,6,7,8.
Immunfenotypisk definert (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSCs (heretter pHSC) ble tidligere ansett som funksjonelt homogene. Nylige enkeltcelleanalyser har imidlertid vist at pHSC fortsatt viser heterogenitet med hensyn til deres selvfornyelseskapasitet9,10 og multipotens11,12. Spesielt synes to populasjoner å eksistere i pHSC-fraksjonen med hensyn til deres selvfornyelseskapasitet: langsiktige hematopoietiske stamceller (LT-HSC), som har kontinuerlig selvfornyelseskapasitet, og kortsiktige hematopoietiske stamceller (ST-HSC), som har forbigående selvfornyelseskapasitet 9,10.
Til dags dato er de molekylære mekanismene for selvfornyelseskapasitet som skiller LT-HSC og ST-HSC fortsatt dårlig forstått. Det er avgjørende å isolere begge cellepopulasjonene basert på deres selvfornyelseskapasitet og å oppdage underliggende molekylære mekanismer. Flere reportersystemer har også blitt introdusert for å rense LT-HSC13,14,15; LT-HSC-renheten definert av hvert rapporteringssystem er imidlertid variabel, og eksklusiv LT-HSC-rensing er ikke oppnådd til dags dato.
Derfor vil utviklingen av et isolasjonssystem for LT-HSC og ST-HSC akselerere forskningen om selvfornyelseskapasitet i pHSC-fraksjonen. I isolasjonen av LT-HSC og ST-HSC identifiserte en studie ved bruk av flertrinns, objektiv screening et enkelt gen, Hoxb5, som er heterogent uttrykt i pHSC-fraksjonen16. I tillegg viste benmargsanalyse av Hoxb5-reportermusene at omtrent 20% -25% av pHSC-fraksjonen består av Hoxb5 pos-celler. En konkurransedyktig transplantasjonsanalyse ved bruk av Hoxb5 pos pHSCs og Hoxb5 neg pHSCs viste at bare Hoxb5pos pHSCs har langsiktig selvfornyelseskapasitet, mens Hoxb5 neg pHSCs mister sin selvfornyelseskapasitet innen kort tid, noe som indikerer at Hoxb5 identifiserer LT-HSC i pHSC-fraksjonen16.
Her demonstrerer vi en trinnvis protokoll for å isolere LT-HSC-er og ST-HSC-er ved hjelp av Hoxb5-reportersystemet . I tillegg presenterer vi en konkurransedyktig transplantasjonsanalyse for å vurdere selvfornyelseskapasiteten til Hoxb5pos/neg pHSCs (figur 1). Dette Hoxb5 reportersystemet lar oss prospektivt isolere LT-HSCs og ST-HSCs og bidrar til forståelsen av LT-HSC-spesifikke egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tradisjonelt har celleoverflatemarkørdefinerte HSC-er blitt forberedt på å studere funksjonene til HSC-er, for eksempel selvfornyelseskapasitet og multipotens 19,20,21. Den immunfenotypisk definerte (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-fraksjonen inneholder imidlertid to diskrete HSC-populasjoner: LT-HSCs og ST-HSCs 9,10<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Hiroshi Kiyonari for dyrepleie og for å gi mottakermus ved RIKEN BDR, samt Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka og Masaki Miyahashi for laboratorieledelse ved Kobe University. Forfatterne setter også stor pris på den løpende støtten til dette arbeidet. Masanori Miyanishi ble støttet av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 og JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for medisinsk og farmasøytisk forskning, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders, og AMED-PRIME, AMED under tilskuddsnummer JP18gm6110020. Taro Sakamaki støttes av JSPS KAKENHI tilskuddsnumre JP21K20669 og JP22K16334 og ble støttet av JSPS Core-to-Core Program og RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi ble støttet av JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.
Materials
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
Riferimenti
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
