Erytrocytt sedimenteringshastighet: En fysikkdrevet karakterisering i en medisinsk sammenheng

Summary

Senkningsreaksjon (SR) er en fysisk parameter, ofte brukt i rutinemessige helsekontroller og medisinsk diagnose. En teoretisk modell som gjør det mulig å trekke ut fysisk meningsfulle parametere fra hele sedimentasjonskurven, basert på moderne kolloidal kunnskap, er nylig utviklet. Her presenterer vi en protokoll for automatisk å samle inn ESR over tid, og trekke ut parametrene til denne siste modellen fra denne automatiserte datainnsamlingen. Disse raffinerte parametrene vil sannsynligvis også forbedre det medisinske vitnesbyrdet.

Abstract

Erytrocytt (eller røde blodlegemer) sedimenteringshastighet (ESR) er en fysisk avledet parameter av blod som ofte brukes i rutinemessige helsekontroller og medisinsk diagnose. For eksempel, i tilfelle betennelse, observeres en høyere ESR på grunn av den tilknyttede økningen i fibrinogen og andre plasmaproteiner. Det ble antatt at denne økningen skyldtes dannelsen av større aggregater av røde blodlegemer (RBC) forårsaket av økningen i fibrinogen. Faktisk er fibrinogen en agentfremmende aggregering av RBC og i Stokes-regimet antas å bli observert i blodstørre aggregater sediment raskere. Imidlertid krever alle modeller av ESR-målinger basert på denne hypotesen ytterligere spesifikke fysiske forutsetninger, som ikke kreves i noe annet system. Dessuten har moderne studier innen kolloidale suspensjoner fastslått at attraktive partikler danner perkolerende aggregater (dvs. aggregater så brede som beholderen). Sedimenteringen av disse kolloidene følger da en såkalt “kolloidal gelkollaps”. Nylig har det vist seg at RBC faktisk følger samme oppførsel. Denne hypotesen gjør det også mulig å effektivt og analytisk modellere sedimentasjonskurven til RBC, hvorfra robuste og fysisk meningsfulle beskrivelser kan trekkes ut. Dette manuskriptet beskriver hvordan man utfører en slik analyse, og diskuterer fordelene med denne tilnærmingen.

Introduction

Erytrocytt sedimenteringshastigheten (ESR) er et medisinsk in vitro klinisk verktøy, formelt introdusert i bevisbasert medisin i løpet av det tjuende århundre 1,2,3,4. Det brukes for tiden over hele verden som en ikke-spesifikk inflammatorisk test, eller for å overvåke utviklingen av noen spesifikke forhold 5,6,7,8. Dette skyldes hovedsakelig en økning i fibrinogenkonsentrasjonen, men også i andre plasmakomponenter som IgM 1,9,10,11. I henhold til gjeldende Westergren-standardprotokoll rapporteres ESR-verdier som måling av det cellefrie plasmalaget på et gitt tidspunkt (30 min eller 1 time) etter å ha forlatt et vertikalt rør med en typisk størrelse på 20 cm vertikalt i hvile¹². Denne målemetoden har imidlertid blitt kritisert siden kvalitativt forskjellige stadier i sedimenteringsprosessen er rapportert, inkludert en forsinkelse før maksimal sedimenteringshastighet¹³ er nådd. Denne forsinkelsen varer mer enn 1 time i omtrent halvparten av friske prøver¹⁴. Hastigheten i denne fasen adlyder en annen skalering enn i den andre, raskere fasen av sedimentasjonen¹⁵. Ved å begrense avlesningen til gjennomsnittlig sedimenteringshastighet i løpet av den første timen, sammenlignes deretter en annen blanding av forskjellige blodegenskaper mellom forskjellige individer.

Videre er det nylig påvist at de vanlige teoretiske betraktningene bak denne protokollen var feilaktige^16,17,18. Ved fysiologisk hematokrit (over ca. 25%) sedimenterer ikke røde blodlegemer (RBC) som separate aggregater, men snarere som et kontinuerlig, såkalt perkolerende, nettverk av RBC 17,18, som adlyder et annet sett med fysiske ligninger enn den vanligvis nevnte Stokes sedimentasjon ^16,17. Det er vist at det å vurdere en fysisk beskrivelse basert på tidsoppløste målinger av sedimentasjonen (helkurven) var mer robust i noen nye medisinske sammenhenger^19,20. Videre kan disse målingene brukes til å kaste lys over de fysiske mekanismene som endrer ESR i patologier der celleformer endres^19,20. I tillegg kan en langsom ESR ha en nyttig medisinsk tolkning, som angitt i målingene av en kohort av nevroacanthocytose syndrom pasienter^19,20. Denne artikkelen gjennomgår hvordan du praktisk implementerer måling av fysisk meningsfulle parametere, basert på hele ESR-kinetikken. Mer nøyaktig trekker metoden som presenteres her maksimal sedimenteringshastighet U_m, hvis verdi kan korrigeres for å vurdere effekten av hematokriten til giveren^16,17. Denne parameteren er mer nøyaktig og dermed mer pålitelig enn den tradisjonelle målingen^16,17,19,20.

I tillegg, i noen grunnleggende undersøkelser, i stedet for å overvåke betennelsestilstanden til en gitt pasient, er det interessant å utelukke effekten av hematokrit på ESR 21,22,23, eller å undersøke RBCs rolle i en modifisert ESR 19,20,24,25 mellom ulike givere. Det kan være nyttig å sammenligne prøver som ikke er direkte fulle blodprøver fra pasienter. Derfor kan resuspendering av RBC med en kontrollert hematokrit i det autologe plasmaet, eller i en plasmasubstituent, brukes som det første trinnet i ESR-måling. For eksempel gir oppløsninger av Dextran 70 kDa med en konsentrasjon på 55 mg/ml i fosfatbufret saltvann (PBS) et sedimenteringsområde innenfor kontrollområdet for friske celler¹⁹. Dette manuskriptet viser også hvordan slike trinn bør gjennomføres, og at den presenterte analysen også er relevant i disse tilfellene.

Protocol

Blodprøvetaking og eksperimenter ble godkjent av “Ärztekammer des Saarlandes”, etikkvotum 51/18, og utført etter informert samtykke i henhold til Helsinkideklarasjonen. Standardmålinger bør utføres med etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)-antikoagulert blod (standard EDTA-konsentrasjon på 1,6 mg/ml blod, europeisk norm NF EN ISO 6710), i Westergren-rør. Volumet som kreves for å fylle Westergren-røret, avhenger av produsenten (da nedre deler noen ganger inneholder et bredere reservoar); Volumet skal være ca. 1 ml …

Representative Results

Et eksempel på en korrekt innhentet bildesekvens er gitt som tilleggsfilm 1 (MovieS1.avi). En rekke karakteristiske tilpasninger av modellen er vist for ulike forhold i figur 2. Fibrinogenkonsentrasjonen ble bestemt ut fra fibrinogenkonsentrasjonen i plasma Fib0, forutsatt at serumet ikke har noe fibrinogen i det hele tatt. Derfor Fib = C Fib0, hvor C er plasmavolumfraksjonen i plasma-serumblandingen. I tidligere s…

Discussion

For at den automatiserte protokollen skal fungere effektivt, er det viktig å ha en klar bakgrunn og riktig belysning. En mørk bakgrunn kan forhindre eksistensen av en effektiv binariseringsterskel. For prøver med noe hemolyse, som vanligvis oppstår (øker) over tid, er det viktig å først verifisere at den valgte binariseringsterskelen er relevant for både det første og endelige bildet.

Når det gjelder binariseringsprosessen av bildet, er valget av avkastning og binariseringsterskel de…

Materials

Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample)	SARSTEDT	267001 or 265	Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50	Canon	Kit EF-M18-150 IS STM	Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge	HERMLE	302.00 V03 – Z 36 HK	Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge	MLW	TH21	or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries	Fisher scientific	11884040	or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette)	Gilson	FD10006	Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate	Hirschmann	9120101	Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes	Praxindo	A9244560	Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination	/	/	White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.