Erytrocytsedimenteringshastighet: En fysikdriven karakterisering i ett medicinskt sammanhang

Summary

Erytrocytsedimenteringshastighet (ESR) är en fysisk parameter som ofta används vid rutinmässiga hälsokontroller och medicinsk diagnos. En teoretisk modell som gör det möjligt att extrahera fysiskt meningsfulla parametrar från hela sedimentationskurvan, baserad på modern kolloidal kunskap, har nyligen utvecklats. Här presenterar vi ett protokoll för att automatiskt samla in ESR över tid och extrahera parametrarna för den senaste modellen från denna automatiserade datainsamling. Dessa förfinade parametrar kommer sannolikt också att förbättra det medicinska vittnesmålet.

Abstract

Erytrocyt (eller röda blodkroppar) sedimenteringshastighet (ESR) är en fysisk härledd parameter av blod som ofta används vid rutinmässiga hälsokontroller och medicinsk diagnos. Till exempel, vid inflammation, observeras en högre ESR på grund av den associerade ökningen av fibrinogen och andra plasmaproteiner. Man trodde att denna ökning berodde på bildandet av större aggregat av röda blodkroppar (RBC) orsakade av ökningen av fibrinogen. Faktum är att fibrinogen är en agentfrämjande aggregering av röda blodkroppar och i Stokes-regimen antas observeras i blodstörre aggregatsediment snabbare. Alla modeller av ESR-mätningar baserade på denna hypotes kräver dock ytterligare specifika fysiska antaganden, som inte krävs i något annat system. Dessutom har moderna studier inom kolloidala suspensioner visat att attraktiva partiklar bildar perkolerande aggregat (dvs. aggregat så breda som behållaren). Sedimenteringen av dessa kolloider följer sedan en så kallad “kolloidal gelkollaps”. Nyligen har det visat sig att RBC faktiskt följer samma beteende. Denna hypotes gör det också möjligt att effektivt och analytiskt modellera sedimenteringskurvan för röda blodkroppar, från vilken robusta och fysiskt meningsfulla deskriptorer kan extraheras. Detta manuskript beskriver hur man utför en sådan analys och diskuterar fördelarna med detta tillvägagångssätt.

Introduction

Erytrocytsedimenteringshastigheten (ESR) är ett medicinskt kliniskt verktyg in vitro, formellt introducerat i evidensbaserad medicin under det tjugonde århundradet 1,2,3,4. Det används för närvarande över hela världen som ett ospecifikt inflammatoriskt test, eller för att övervaka utvecklingen av vissa specifika tillstånd 5,6,7,8. Detta beror främst på en ökning av fibrinogenkoncentrationen, men även i andra plasmakomponenter såsom IgM 1,9,10,11. Enligt det nuvarande Westergren-standardprotokollet rapporteras ESR-värden som mätning av det cellfria plasmaskiktet vid en given tidpunkt (30 min eller 1 h) efter att ha lämnat ett vertikalt rör med en typisk storlek på 20 cm vertikalt i vila¹². Denna mätmetod har dock kritiserats eftersom kvalitativt olika steg i sedimenteringsprocessen har rapporterats, inklusive en fördröjning innan maximal sedimenteringshastighet¹³ uppnås. Denna fördröjning varar mer än 1 h i ungefär hälften av friska prover¹⁴. Hastigheten under denna fas följer en annan skalning än under den andra, snabbare fasen av sedimenteringen¹⁵. Genom att begränsa avläsningen till den genomsnittliga sedimenteringshastigheten under den första timmen jämförs sedan en annan blandning av olika blodegenskaper mellan olika individer.

Dessutom har det nyligen visat sig att de vanliga teoretiska övervägandena bakom detta protokoll var felaktiga^16,17,18. Vid fysiologisk hematokrit (över cirka 25%) sedimenterar röda blodkroppar (RBC) inte som separata aggregat, utan snarare som ett kontinuerligt, så kallat perkolerande nätverk av RBC 17,18, som lyder en annan uppsättning fysiska ekvationer än den vanligtvis nämnda Stokes sedimentation ^16,17. Det har visat sig att betraktandet av en fysisk beskrivning baserad på de tidsupplösta mätningarna av sedimentationen (hela kurvan) var mer robust i vissa nya medicinska sammanhang^19,20. Dessutom kan dessa mätningar användas för att belysa de fysiska mekanismerna som förändrar ESR i patologier där cellformer förändras^19,20. Dessutom kan en långsam ESR ha en användbar medicinsk tolkning, vilket indikeras i mätningarna av en kohort av patienter med neuroacanthocytossyndrom^19,20. Denna artikel granskar hur man praktiskt implementerar mätningen av fysiskt meningsfulla parametrar, baserat på hela ESR-kinetiken. Mer exakt extraherar metoden som presenteras här den maximala sedimenteringshastigheten U_m, vars värde kan korrigeras för att överväga effekten av hematokriten hos givaren^16,17. Denna parameter är mer exakt och därmed mer tillförlitlig än den traditionella mätningen^16,17,19,20.

Dessutom, i viss grundläggande forskning, istället för att övervaka inflammationstillståndet hos en given patient, är det intressant att utesluta effekten av hematokrit på ESR 21,22,23, eller att undersöka rollen av RBC i en modifierad ESR 19,20,24,25 mellan olika givare. Det kan vara användbart att jämföra prover som inte är direkt fullständiga blodprover från patienter. Därför kan resuspendering av röda blodkroppar med en kontrollerad hematokrit i autolog plasma, eller i ett plasmasubstituent, användas som det första steget i ESR-mätningen. Exempelvis ger lösningar av Dextran 70 kDa med en koncentration på 55 mg/ml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) ett sedimentationsintervall inom kontrollområdet för friska celler¹⁹. Detta manuskript visar också hur sådana steg bör genomföras, och att den presenterade analysen också är relevant i dessa fall.

Protocol

Blodprovsinsamling och experiment godkändes av “Ärztekammer des Saarlandes”, etik votum 51/18, och utfördes efter att informerat samtycke erhölls enligt Helsingforsdeklarationen. Standardmätningar bör utföras med etylendiamintetraättiksyra (EDTA)-antikoagulerat blod (standard EDTA-koncentration på 1,6 mg/ml blod, europeisk norm NF EN ISO 6710), i Westergren-rör. Volymen som krävs för att fylla Westergren-röret beror på tillverkaren (eftersom nedre delar ibland innehåller en bredare behållare); Volymen bö…

Representative Results

Ett exempel på en korrekt förvärvad bildsekvens tillhandahålls som kompletterande film 1 (film1.avi). En serie karakteristiska passformer av modellen visas för olika förhållanden i figur 2. Fibrinogenkoncentrationen bestämdes utifrån fibrinogenkoncentrationen i plasma Fib0, förutsatt att serumet inte har något fibrinogen alls. Därför är Fib = C Fib0, där C är plasmavolymfraktionen i plasma-serumblandningen. <em…

Discussion

För att det automatiserade protokollet ska fungera effektivt är det viktigt att ha en tydlig bakgrund och korrekt belysning. En mörk bakgrund kan förhindra förekomsten av en effektiv binariseringströskel. För prover med viss hemolys, som vanligtvis uppträder (ökar) över tid, är det viktigt att först verifiera att den valda binariseringströskeln är relevant för både den första och slutliga bilden.

När det gäller binariseringsprocessen för bilden är valet av ROI och binarise…

Materials

Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample)	SARSTEDT	267001 or 265	Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50	Canon	Kit EF-M18-150 IS STM	Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge	HERMLE	302.00 V03 – Z 36 HK	Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge	MLW	TH21	or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries	Fisher scientific	11884040	or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette)	Gilson	FD10006	Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate	Hirschmann	9120101	Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes	Praxindo	A9244560	Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination	/	/	White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.