Her præsenterer vi en protokol til dyrkning af IDG-SW3-celler i en tredimensionel (3D) ekstracellulær matrix.
Osteocytter anses for at være ikke-proliferative celler, der er terminalt differentieret fra osteoblaster. Osteoblaster indlejret i knogleekstracellulær matrix (osteoid) udtrykker Pdpn-genet til dannelse af cellulære dendritter og omdannes til preosteocytter. Senere udtrykker preosteocytter Dmp1-genet for at fremme matrixmineralisering og derved omdanne til modne osteocytter. Denne proces kaldes osteocytogenese. IDG-SW3 er en velkendt cellelinje til in vitro-undersøgelser af osteocytogenese. Mange tidligere metoder har brugt kollagen I som hoved- eller den eneste komponent i dyrkningsmatrixen. Ud over kollagen I indeholder osteoidet imidlertid også et grundstof, som er en vigtig komponent i at fremme cellulær vækst, vedhæftning og migration. Derudover er matrixsubstansen gennemsigtig, hvilket øger gennemsigtigheden af den kollagen I-formede gel og hjælper således udforskningen af dendritdannelse gennem billeddannelsesteknikker. Således beskriver dette papir en protokol til etablering af en 3D-gel ved hjælp af en ekstracellulær matrix sammen med kollagen I til IDG-SW3-overlevelse. I dette arbejde blev dendritdannelse og genekspression analyseret under osteocytogenese. Efter 7 dages osteogen kultur blev et omfattende dendritnetværk tydeligt observeret under et fluorescenskonfokalmikroskop. PCR i realtid viste, at mRNA-niveauerne af Pdpn og Dmp1 kontinuerligt steg i 3 uger. I uge 4 afslørede stereomikroskopet en uigennemsigtig gel fyldt med mineralpartikler, i overensstemmelse med røntgenfluorescensanalysen (XRF). Disse resultater indikerer, at denne kulturmatrix med succes letter overgangen fra osteoblaster til modne osteocytter.
Osteocytter er terminalt differentierede celler afledt af osteoblaster 1,2. Når osteoblasten er begravet af osteoiden, gennemgår den osteocytogenese og udtrykker Pdpn-genet til dannelse af preosteocytter, Dmp1-genettil mineralisering af osteoiden og Sost– og Fgf23-generne til at fungere som en moden osteocyt i knoglevæv3. Her introduceres et 3D-dyrkningssystem til at identificere dendritforlængelse og markørgenekspression i osteocytogeneseprocessen.
IDG-SW3-celler er en udødeliggjort primær cellelinje afledt af transgene mus og kan udvide eller replikere osteoblast til sen osteocytdifferentiering, når de dyrkes i forskellige medier4. Sammenlignet med MLO-A5, MLO-Y4 og andre cellelinjer er ekspressionsprofilen for funktionelle proteiner, evnen til at udføre calciumsaltaflejring og reaktionerne på forskellige hormoner i IDG-SW3-celler mere tilbøjelige til at være de samme som for primære osteocytter i knoglevævet4.
Sammenlignet med 2D-systemer er 3D-dyrkningssystemer mere i stand til at efterligne di vivo-cellulært vækstmiljø, herunder næringsgradienten, lav mekanisk stivhed og omgivende mekanisk rækkevidde (tabel 1). De fleste af de tidligere metoder til dyrkning af osteoblastiske celler i et 3D-system brugte kollagen I som den unikke komponent i formulering 4,5,6, fordi kollagen I-fibre tjener som stedet for calcium- og fosforaflejring. Imidlertid indeholder en uundværlig bestanddel i osteoiden, den ekstracellulære matrix, en stor gruppe cellulære faktorer, der fremmer cellulær vækst, vedhæftning og migration 7,8 og er gennemsigtig og praktisk til billeddannelsesobservation. Denne protokol anvender således Matrigel (i det følgende benævnt kældermembranmatrix) som en sekundær komponent til osteocytogeneseundersøgelsen.
Et kritisk punkt i denne protokol er, at trin 1 og trin 2 skal udføres på is for at forhindre spontan koagulation. I denne metode var den endelige koncentration af kollagen I 1,2 mg/ml. Således bør et optimalt ddH2O-volumenberegnes for at matche de forskellige kollagener fra forskellige producenter.
In vivo involverer osteocytogenese en polær bevægelse af osteoblaster fra overfladen til det indre af trabekulær knogle14. Denne protokol frigør …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Lynda F. Bonewald for at give IDG-SW3-cellelinjen i gave. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82070902, 82100935 og 81700778) og Shanghai “Science and Technology Innovation” Sailing Project (21YF1442000).
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |